小白菜與大白菜亞種間雜交減數(shù)分裂染色體行為觀察

陳龍正，徐 海，宋 波，樊小雪

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇　南京　210014）

小白菜與大白菜亞種間雜交減數(shù)分裂染色體行為觀察

陳龍正，徐 海，宋 波，樊小雪

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇南京210014）

研究了小白菜與大白菜亞種間雜交及回交世代花粉母細胞減數(shù)分裂行為，發(fā)現(xiàn)雜種F1花粉可染率90.7%，表現(xiàn)出較好的育性；回交BC1-3花粉可染率升高，表明育性逐步提高.F1花粉母細胞減數(shù)分裂正常染色體行為細胞數(shù)占總觀察數(shù)的89.1%，這解釋了F1具有較好育性的原因.雜種F1減數(shù)分裂各個時期會出現(xiàn)不正?，F(xiàn)象，如雙核仁、配對紊亂、染色體橋、染色體片段丟失等，這在一定程度上可以說明雜種F1育性低于正常二倍體的原因.14.3%的BC1花粉母細胞會出現(xiàn)不正?，F(xiàn)象，而BC2-3已經(jīng)相對正常，極少觀察到減數(shù)分裂不正?，F(xiàn)象，表明在回交過程中染色體穩(wěn)定是一個快速的過程，這與表型及育性調(diào)查結(jié)果相吻合.

白菜；亞種間雜交；減數(shù)分裂；染色體行為

遠緣雜交產(chǎn)生的F1代雜種包含了兩個不同的染色體組，因而新形成的遠緣雜種往往會受到“基因組沖擊”（Genomic shock）：即兩個不同的基因組進入到一個共同的核中，由于缺乏同源性，兩個單倍性染色體組在減數(shù)分裂時不能正常配對，導(dǎo)致育性降低甚至高度不育［1-2］.然而，如果親緣關(guān)系較近或者同源性較高的兩個染色體組組合到同一細胞核中，由于同源染色體的存在，形成初期會發(fā)生聯(lián)會正常，具有部分育性.

小白菜（Brassica campestris ssp.Chinensis Makino）又叫不結(jié)球白菜，屬蕓薹屬白菜種不結(jié)球白菜亞種，與大白菜（Brassica camperstris ssp.pekinens）屬同種不同亞種.已有的研究表明，小白菜與大白菜之間由于親緣關(guān)系較近，不存在生殖隔離現(xiàn)象，雜交的親和性較好［3-5］.但是，理論上兩套不同的染色體組組合到同一細胞質(zhì)中，由于非同源染色體的存在，導(dǎo)致減數(shù)分裂不正常［6］.盡管小白菜與大白菜亞種間雜交育性較好，在減數(shù)分裂過程中是否會出現(xiàn)染色體異?，F(xiàn)象，是否存在修復(fù)機制卻鮮有報道.本研究對小白菜與大白菜亞種間雜交F1進行減數(shù)分裂染色體行為進行觀察，為探索兩套染色體組合到同一胞質(zhì)中修復(fù)機理奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1材料

小白菜‘T青'由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供.大白菜‘CCR13025'為抗根腫病高代自交系，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供.通過亞種間雜交獲得了雜種F1代，以‘T青'為輪回親本進行回交并選擇，獲得抗根腫病BC3代［7］.對各世代進行群體取樣，每個群體20～30株.

1.2方法

取0.5～2mm大小的幼小花蕾，用改良卡諾氏固定液（無水乙醇∶氯仿∶冰醋酸=5∶2∶3）固定24h，然后轉(zhuǎn)到70%的酒精中放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?參照錢春桃等［8］染色體制片方法進行制片，用卡寶品紅染色.采用火焰微烤和45%醋酸分色制片.用OLYMPUS（BX-51）顯微鏡觀察和拍照.

花粉生活力測定，是以在1%TTC溶液中可染色花粉的百分率統(tǒng)計.用SPSS（11.0）進行數(shù)據(jù)分析.

表1　不同世代花粉母細胞減數(shù)分裂正常比例Tab.1 Ratio of normal meiosis PMCs in different generations

2　結(jié)果與分析

2.1雜種及回交后代不同世代花粉育性調(diào)查

雜種F1花粉可染率達90.7%（表1），表現(xiàn)出較好的育性.回交BC1、BC2和BC3花粉可染率分別為92.4%、95.9%和96.4%（表1），呈逐步上升趨勢，表明其育性逐步提高.對減數(shù)分裂花粉母細胞進行觀察，每個世代隨機抽取30～60個花粉母細胞進行統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1花粉母細胞減數(shù)分裂正常染色體行為細胞比例占總觀察數(shù)的89.1%，只有8.9%的細胞表現(xiàn)不正常，這在一定程度上解釋了F1具有較好育性. BC1減數(shù)分裂正常比例占85.7%，BC2和BC3分別是94.2%和93.8%（表1）兩者差異不顯著，但顯著高于BC1，說明隨著代數(shù)升高，減數(shù)分裂越來越正常，而且是一個快速的過程.

2.2雜種F1減數(shù)分裂異?，F(xiàn)象

雜種F1在減數(shù)分裂除了正常染色體行為外，在各個時期少數(shù)花粉母細胞會出現(xiàn)不正常現(xiàn)象.在所有不正常減數(shù)分裂花粉母細胞中，主要表現(xiàn)為前期I出現(xiàn)雙核仁現(xiàn)象，通常出現(xiàn)1個大核仁和1個小核仁（圖1-A1-3）.極少數(shù)花粉母細胞會出現(xiàn)粗線期交叉結(jié)（圖1-B1），終變期染色體配對紊亂（圖1-B2），中前期形成四價體（圖1-B3：2個四價體；圖1-B4：1個四價體）.

在后期I紡錘絲牽引染色體分離出現(xiàn)減數(shù)分裂不同步現(xiàn)象（圖1-C1-2），由于多價體的形成出現(xiàn)染色體橋（圖1-D）和染色體片段的丟失（圖1-E1-2）.試驗中還觀察到另一種減數(shù)分裂不同步現(xiàn)象即同一花蕾中，花粉母細胞減數(shù)分裂時期的不同步，有些花粉母細胞處于前期，而部分細胞已經(jīng)到了中后期（圖1-F），這些染色體異常行為，導(dǎo)致了亞種間雜種F1花粉母細胞發(fā)育出現(xiàn)不正常（圖1-G），最終導(dǎo)致了亞種間雜種部分花粉敗育.

2.3BC1-3減數(shù)分裂染色體行為觀察

BC1在減數(shù)分裂除了正常染色體行為外，在各個時期少數(shù)花粉母細胞會出現(xiàn)不正?，F(xiàn)象.在不正常減數(shù)分裂花粉母細胞中，主要表現(xiàn)為前期I出現(xiàn)雙核仁、減數(shù)分裂不同步、染色體橋、染色體片段的丟失等.

BC2-3花粉母細胞減數(shù)分裂已經(jīng)相當正常，極少觀察到減數(shù)分裂不正?，F(xiàn)象.在前期Ⅰ，細線期：染色體凝結(jié)成細絲狀，附著在核仁一側(cè)，形成了所謂的“花束”狀染色體（圖2-A）.粗線期：同源染色體完成配對，比細線期粗（圖2-B）.雙線期：染色體進一步收縮變粗，染色體明顯比粗線期短（圖2-C）.終變期：染色體更小與中期染色體大小基本相同（圖2-D）.前期Ⅰ結(jié)束后，核仁解體.中期Ⅰ，染色體被紡錘絲牽引定位并緊密排列在赤道板上（圖2-E）.后期Ⅰ同源染色體通過紡錘絲的牽引（圖2-F），分別移向兩極（圖2-G）.末期Ⅰ同源染色體平均分配到兩極（圖2-H）.染色體開始解螺旋，但沒有形成細胞板（圖2-I），說明小白菜減數(shù)分裂為同時型胞質(zhì)分裂.

圖1　雜種F1減數(shù)分裂染色體異常行為觀察Fig.1 Observation of abnormal meiotic behavior in F1hybrid

在兩極的核仁解體和核膜消失之后，花粉母細胞進入第二次減數(shù)分裂.前期Ⅱ，兩級再次出現(xiàn)清晰的染色體（圖2-J）.中期Ⅱ，兩組染色體由紡錘絲牽引在赤道板上（圖2-K）.后期Ⅱ姊妹染色單體發(fā)生分離，隨后被平均分配到四極（圖2-L）.單分體染色體到達四極后即開始解螺旋，染色體消失（圖2-M）.隨后，經(jīng)過細胞質(zhì)分裂形成四分體（圖2-N），最后發(fā)育成成熟的花粉粒（圖2-O）.

3　討論

遠緣雜交是植物進化中的自然現(xiàn)象，是促進植物進化的主要動力之一，有利于拓寬遺傳背景，促進外源優(yōu)異基因的交流和利用.遠緣雜交產(chǎn)生的雜種F1花粉粒育性與其親緣關(guān)系遠近有關(guān)，這主要取決于同源染色體配對難易程度［9］.本研究中，小白菜與大白菜同屬蕓薹屬白菜種不同亞種，染色體數(shù)相同（2n=2x=20），親緣關(guān)系相近，同源染色體較易配對，因此亞種間雜種F1花粉母細胞減數(shù)分裂相對正常，這在很大程度上可以解釋盡管大白菜與小白菜在形態(tài)上差別較大，但它們之間雜交不存在生殖隔離情況的原因.但是，由于大白菜與小白菜染色體之間具有非同源性，因此在減數(shù)分裂中期Ⅰ出現(xiàn)了少量的非二價體形態(tài)的配對，后期出現(xiàn)染色體滯后、染色體橋、染色體片段丟失及染色體不同步分離等現(xiàn)象，導(dǎo)致其育性只有85.7%低于正常二倍體理論值100%.

通過回交轉(zhuǎn)育，理論上在BC3代，輪回親本（小白菜）核基因組占總基因組的15/16，BC3代的表型已經(jīng)非常接近輪回親本［7］.在細胞學(xué)上，回交高世代材料理論上應(yīng)該更加趨向于二倍化的減數(shù)分裂.本研究發(fā)現(xiàn)，在回交3代后，減數(shù)分裂正常細胞數(shù)目由85.7%上升為94.2%，BC2與BC3已經(jīng)沒有顯著性差異，表明在回交過程中染色體穩(wěn)定是一個快速的過程，這與表型［7］及本研究育性（花粉可染率）調(diào)查結(jié)果相吻合.

在對以往遠緣雜交的研究中發(fā)現(xiàn)，雜交后代主要通過DNA重排［10］、基因組同源序列的消除［11-13］、染色體組的重組［14］等機制，促進減數(shù)分裂中同源染色體的正確配對，從而產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的物種.本研究發(fā)現(xiàn)，在雜種F1及回交過程中出現(xiàn)了染色體片段的丟失等現(xiàn)象，一定程度上驗證了以上假說.在表型觀察中發(fā)現(xiàn)，在回交過程中，大白菜葉翼、葉片有毛、包心等現(xiàn)象逐漸丟失，這些重要表型性狀的丟失與回交過程中染色體重組、片段丟失等變化之間的關(guān)系，目前尚不清楚，需要進一步研究.

圖2　BC3花粉母細胞減數(shù)分裂過程Fig.2 Meiosis of pollen mother cells in BC3

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責(zé)任編輯：高 山

Chromosome Behaviors in Meiotic of Pollen Mother Cells in Inter-subspecific Hybridization between Chinese Cabbage and Non-heading Chinese Cabbage

CHEN Longzheng，XU Hai，SONG Bo，F(xiàn)AN Xiaoxue
（Vegetable Research Institute，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

Meiotic behaviors of pollen mother cells（PMCs）in inter-subspecific hybrid F1and BC1-3between Chinese cabbage and non-heading Chinese cabbage were studied.It was observed that 90.7%of F1pollen were stainable，indicating good fertility.The fertility of BC1-3was gradually increased.89.1%chromosome behavior in F1meiotic PMCs was regular which could explain the good fertility.Abnormal chromosome behaviors such as double nucleoli，disordered paring in Prophase I，chromosome bridge in metaphase I，segments loss in anaphase I were discovered which could explain the lower fertility of F1hybrid than normal diploid.14.3%abnormal chromosome behaviors were found in BC1generation however very limited in BC2-3which indicated that it was a repaid process for chromosome behavior of backcross generation becoming normal；this result was consistent to phenotype and fertility investigation.

Chinese cabbage；inter-subspecific hybrid；meiosis；chromosome behaviors

S634.3

A

1008-8423（2015）04-0421-04DOI：10.13501/j.cnki.42-1569/n.2015.12.017

2015-10-10.

江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK20130715）；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費項目（201403032）.

陳龍正（1980-），男，博士，副研究員，主要從事蔬菜遺傳育種的研究.