凝膠色譜法測定頭孢菌素類藥物中高分子雜質(zhì)的應(yīng)用心得

祝飚　李蕾

【摘要】實(shí)際上，所謂的凝膠色譜法也是一種凝膠色譜技術(shù)，更是一種十分快捷、簡單的分離分析技術(shù)，其由于具備分離效果理想，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，因此受到了相關(guān)研究人員的喜愛，并在頭孢菌素類藥物中高分子雜質(zhì)測定中得到了十分廣泛的應(yīng)用，具有一定的推廣價(jià)值。因此，筆者通過結(jié)合自身多年實(shí)踐工作經(jīng)驗(yàn)，針對采用凝膠色譜法對頭孢菌素類藥物中高分子雜質(zhì)的測定進(jìn)行了詳細(xì)的論述，簡單介紹了相關(guān)操作流程，并得出以下相關(guān)結(jié)論，以供同行業(yè)人員參考交流。

【關(guān)鍵詞】凝膠色譜法 頭孢菌素類藥物 高分子雜質(zhì) 測定

【中圖分類號】R927.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0220-01

目前，根據(jù)大量臨床驗(yàn)證研究表明，大部分由抗生素引起的過敏性反應(yīng)普遍是與藥品中含有的高分子雜質(zhì)有關(guān)聯(lián)。由此，我們可以判斷出，高分子雜質(zhì)含量的多少將會對藥品安全性造成極大的影響，甚至還會對人們的身體健康構(gòu)成威脅。因此，為了保障藥物質(zhì)量，進(jìn)一步提高藥品純度，防止不良時(shí)間的發(fā)生，我們必須通過采取相關(guān)有效的測定方法，有效檢測出頭孢菌素類藥物中高分子雜質(zhì)的含量。對此，本文將重點(diǎn)對凝膠色譜法測定頭孢菌素類藥物中高分子雜質(zhì)的應(yīng)用心得進(jìn)行了闡釋。

一儀器與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備上的注意事項(xiàng)

通常情況下，在采用凝膠色譜法對頭孢菌素類藥物中高分子雜質(zhì)含量進(jìn)行測定時(shí)，必須要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室中相關(guān)的檢定過程，全面掌握各種儀器設(shè)備的操作規(guī)范，從而確保測量結(jié)果的精確性。

1、儀器準(zhǔn)備

在實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備階段中，若是決定采用自行配置的簡單儀器設(shè)備，就要充分做好檢測單元、輸液單元以及數(shù)據(jù)記錄處理單元的三方面工作。其中，檢測環(huán)節(jié)是為了保證滿足于紫外檢測要求，而輸液單位則是為實(shí)驗(yàn)順利開展所提供的可靠流速，同時(shí)通過對色譜工作站發(fā)出模擬信號，以便于后續(xù)數(shù)據(jù)的記錄處理。并且，在自行配置儀器系統(tǒng)使用過程中，一定要確保符合液相色譜儀的測定要求，制定出規(guī)范合理的檢測規(guī)程，定期進(jìn)行檢定，以此來保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。

2、凝膠色譜柱準(zhǔn)備

在色譜柱規(guī)格的選擇上應(yīng)該從儀器系統(tǒng)的最大進(jìn)樣能力、所分析樣品的溶解能力以及檢測限度等方面綜合進(jìn)行考慮。通常凝膠色譜柱的體積小于柱床體積，所以一般頭孢菌素抗生素高分子雜質(zhì)測定的柱床體積應(yīng)為60ml以上。

3、玻璃柱管的分端及凝膠介質(zhì)的選取

在玻璃柱管的分端上，一般開口的玻璃柱管可以采用玻璃棉加開口橡膠塞來封端，也可以在一端燒結(jié)石英過濾板或者通過直接購買帶調(diào)節(jié)頭的商品玻璃柱管。凝膠色譜法在凝膠介質(zhì)的選取上可選用的凝膠有很多種，目前對抗生素高分子雜質(zhì)的測定多數(shù)采用的是葡聚糖凝膠，選取這種凝膠介質(zhì)后一定要注意在使用之前需用水充分的溶脹，可以根據(jù)需要填制的凝膠柱柱床體積來具體計(jì)算用量。如果溶脹使采用蒸餾水浸泡的方式，也可以在溫度為4℃的冰箱中放置48小時(shí)，也可在水浴中煮沸一小時(shí)，這樣才能保證溶脹充分。在這兩種溶脹方式中都應(yīng)該注意隨時(shí)攪拌出去氣泡，必要情況下還可以進(jìn)一步的進(jìn)行真空脫氣。

4、裝柱

將溶脹好的凝膠介質(zhì)用蒸餾水懸浮靜置后，每次傾去上層液，以去除凝膠碎屑和雜質(zhì)。按照這種方法進(jìn)行多次洗滌，直到上層的精置液澄清為止。實(shí)踐中可將凝膠介質(zhì)用水制成懸漿，然后一次性的倒人垂直放置的玻璃柱管中，待凝膠顆粒沉降完畢后即完成裝柱。也可在垂直放置的玻璃柱管和漏斗上放開柱管下口，保持液流順暢，用滴灌逐管從漏斗中加入凝膠懸漿，讓凝膠顆粒在蒸餾水中緩慢沉降，注意讓漏斗中隨時(shí)保持一定的凝膠懸漿。運(yùn)用此種方法會使裝柱得時(shí)間較長，必要時(shí)可以在出柱口增加負(fù)壓加快裝柱時(shí)間。

二系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)對溶液的制備更加注重方便性和可操作性，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液的配制方法為用主成分對照品與雜質(zhì)對照品混合配制，但還是會使得有些雜質(zhì)對照品不能得到，如性質(zhì)不穩(wěn)定或分離提取技術(shù)要求太高等，但這些雜質(zhì)峰恰恰又是與主成分峰最難分離的色譜峰。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)?zāi)壳鞍ê芏鄡?nèi)容，主要考察對照品測定系統(tǒng)與高分子雜質(zhì)測定系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖2000溶液峰的保留時(shí)間的比值，以及理論板數(shù)和拖尾因子，以此來控制對照品測定與高分子雜質(zhì)測定時(shí)儀器狀態(tài)的同一性。在以藍(lán)色葡聚糖2000的保留時(shí)間來表示高分子雜質(zhì)的保留特征時(shí)，對照品色譜峰及高分子雜質(zhì)色譜峰與藍(lán)色葡聚糖2000溶液色譜峰保留時(shí)間的比值都應(yīng)控制在一定的限度內(nèi)，由此才能實(shí)現(xiàn)對色譜柱狀態(tài)的正?？刂?。

三操作方法上的注意事項(xiàng)

1、樣品溶液及對照溶液的制備

具體操作中必須要按規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)來配制樣品溶液，由于某些高濃度抗生素溶液具有一定的不穩(wěn)定性，所以通常對樣品溶液采取即溶即進(jìn)的形式。對照溶液的制備上，要注意頭孢菌高分子雜質(zhì)的含量測定，通常以樣品自身在SDS水溶液或純水中的締合物作為對照進(jìn)行定量。在制備締合物時(shí)特別要注意對濃度及水的純度的控制，以此來保證締合完全。

2、進(jìn)樣及進(jìn)樣方式

一般我們在對頭孢菌素高分子雜質(zhì)含量進(jìn)行測定時(shí)，通常需要不同狀態(tài)的流動相，選擇出合適的對照溶液進(jìn)行進(jìn)樣。因此，只有事先將流動相更換之后，才能充分保證凝膠色譜柱的平衡性。并且，筆者建議盡量采用凝膠色譜儀自動進(jìn)樣方式，或是在特殊情況下，選擇手動進(jìn)樣。然而，無論是任何一種進(jìn)樣方式，在實(shí)驗(yàn)中，都必須保證色譜柱端無縫隙處，從而避免樣品擴(kuò)散，影響分離效果。另外，在對頭孢菌素高分子進(jìn)行自動取樣的過程中，也要切實(shí)遵守相關(guān)的液相色譜操作規(guī)程。

3、凝膠面的平整

如果選擇了手動進(jìn)樣方式，就一定要保證凝膠表面的平整性和完整性。并在進(jìn)樣之前，事先使用滴管吸取掉凝膠表面積壓的液體，確保色譜柱下端能夠順利流通，直到色譜柱內(nèi)的溶液流降到凝表面時(shí)，我們才可以應(yīng)用相應(yīng)的定量器具，對樣品溶液進(jìn)行精密的量取。之后，我們還需要將樣品溶液滴加到色譜柱的凝膠表面中，同時(shí)還要對色譜柱管內(nèi)壁上殘留的樣品溶液進(jìn)行清洗。最后，也是最重要的一個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員要在色譜柱頂端緩慢注入適量的流動相，認(rèn)真做好進(jìn)樣時(shí)間的記錄工作。

4、記錄對照及結(jié)果

要分別記錄樣品和對照溶液的色譜圖，積分對照溶液的峰面積和樣品溶液中處于外水體積的高聚物雜質(zhì)面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中高分子雜質(zhì)的含量。按平行實(shí)驗(yàn)的平均值作為樣品中高分子雜質(zhì)含量的最終結(jié)果，并與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限度比較后作出是否符合規(guī)定的判斷。

5、樣量分析

在一般高效液相色譜儀上使用凝膠柱，應(yīng)嚴(yán)格限制泵壓。由于一般高壓液相色譜管路和檢測器通路狹窄，極易發(fā)生堵塞，所以要注意盡量減少將出柱液連接到檢測器的時(shí)間，尤其是新填充的色譜柱更應(yīng)經(jīng)水或流動相充分平衡后再連接到檢測器。

四結(jié)束語

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大部分抗生素藥物中的高分子雜質(zhì)已經(jīng)超出了藥物本身的雜質(zhì)，嚴(yán)重影響了藥物質(zhì)量，殘留了部分污染物質(zhì)，再加之抗生素在貯存過程中，其分子很容易發(fā)生聚合反應(yīng)，最終產(chǎn)生大量的聚合物雜質(zhì)，大大降低了藥品的純度。因此，采用高效的凝膠色譜法對頭孢菌素中的高分子雜質(zhì)含量的測量是非常至關(guān)重要的，操作人員必須嚴(yán)格遵守相應(yīng)的檢測要求，加強(qiáng)對凝膠色譜法的合理運(yùn)用及改進(jìn)，進(jìn)一步提高頭孢菌素類型藥物的質(zhì)量和純度，從而達(dá)到理想的治療效果。

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