老瓜頭耐鹽內(nèi)生真菌抗真菌活性篩選研究

劉悅 段海婧 劉成 吳秀麗 陳靖

摘要

[目的] ?對荒漠植物老瓜頭（Cynanchum komarovii Al. Iljinski）中以稻瘟霉模型初篩得到的耐鹽內(nèi)生真菌進行抗真菌活性復(fù)篩。[方法] ?采用微量液基稀釋法，以白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、新生隱球菌、石膏狀小孢子菌、紅色毛癬菌、煙曲霉菌等8株常見病原真菌為活性篩選菌株，進行抗真菌活性復(fù)篩，檢測供試品的最低抑菌濃度（MIC）。[結(jié)果] ?菌株5%-11對新生隱球菌有一定的抑制活性（MIC=32 μg/ml），其他菌株對8株常見病原菌的活性較弱（MIC>64 μg/ml）。[結(jié)論] ?復(fù)篩得到一株對新生隱球菌有抑制活性的耐鹽內(nèi)生真菌。

關(guān)鍵詞 老瓜頭;耐鹽;抗真菌;內(nèi)生真菌;MIC

中圖分類號 S188 ?文獻標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2015）03-012-03

Study on AntiFungi Efficacy of AntiSalt Endophytic Fungi Obtained from Cynanchum komarovii

LIU Yue¹， DUAN Haijing²， LIU Cheng³， CHEN Jing1* et al

（1. Hui Medicine Modern Engineering Research Center， School of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan， Ningxia 750004; 2. School of Pharmacy of Gansu University of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou， Gansu 730000; 3. Science and Technique Center， Ningxia Medical University， Yinchuan， Ningxia 750004）

Abstract [Objective] This paper aimed to give a secondary screening on antifungal activities of antisalt endophytic fungi primarily obtained from Cynanchum komarovii by Magnaporthe grisea model. [Method] By the micro liquid dilution method， 8 common pathomycete strains were chose as active screening strains， namely Canidia albicans， Candida parapsilosi， smooth Candida mycoderma bacteria， Cryptococcus neoformans， Microsporum gypseum， Trichophyton rubrum， Aspergillus fumigatus， etc. Minimum inhibitory concentration （MIC） was determined. [Result] Strain 5%11 has an inhibition activity （MIC=32 μg/ml） on Cryptococcus neoformans， but other strains have a weak bioactivity or no efficacy on 8 pathomycete（MIC>64 μg/ml）. [Conclusion] One antisalt endophytic fungous which has an inhibition effect on Cryptococcus neoformans was obtained by a secondary screening.

Key words ?Cynanchum komarovii; Antisalt; Antipathomycete; Endophytic fungus; MIC

基金項目 寧陜合作項目（細胞膜色譜法篩選老瓜頭鎮(zhèn)痛活性成分及提取工藝研究）;2012年寧夏醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201210752003）。

作者簡介

劉悅（1993-），女，四川漢源人，本科生，專業(yè)：藥學(xué)。*通訊作者，教授，博士，從事沙生植物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

收稿日期 20141203

研究表明，植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物活性成分相同或相似的生物活性物質(zhì)，其中存在大量具有抗菌活性、抗腫瘤活性、抗病毒活性及其他生物活性的次級代謝產(chǎn)物^[1]。許多具有藥理活性的內(nèi)生真菌被陸續(xù)篩選出來，因此通過植物內(nèi)生真菌篩選新穎、高效、低毒的生物活性物質(zhì)具有巨大的潛力，為開發(fā)新的抗生素、抗菌藥物及保護荒漠植物提供重要依據(jù)。大量研究表明，植物內(nèi)生真菌代謝物具有抗菌作用。周生亮等^[2]對5種藥用植物內(nèi)生真菌抑菌活性進行了研究，結(jié)果表明5種藥用植物中共分離出124株內(nèi)生真菌，其中37株內(nèi)生真菌對一種或多種供試菌株有抑制作用，高抑菌活性菌株有11株。李治瀅等^[3]從川烏植物中分離得到61株內(nèi)生真菌，有29株具有抗菌活性，其中抗菌譜廣且活性高的有3株。李桂玲等^[4]從三尖杉（Cephalotaxus fortunei Hook.f.）、南方紅豆杉（Taxus Chinensis var. mairei）及香榧（Torreya grandis Merrillii）中分離出172株內(nèi)生真菌，對其進行抗菌活性檢測，結(jié)果表明90株內(nèi)生真菌對一種或多種植物病原真菌等有抑制作用。趙春安等^[5]從華鳳仙（Impatiens chinensis L.）、問荊（Equisetum arvense L.）和輪葉狐尾藻（Myriophyllum verticillatum L.）3種植物中共分離到內(nèi)生真菌155株，同時對其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進行抗菌活性研究。結(jié)果表明，有37株內(nèi)生真菌（占分離菌株總數(shù)的23.9%）顯示出對一種或多種病原菌的抑菌活性。

在稻瘟霉模型活性初篩的基礎(chǔ)上，采用微量液基稀釋法，以白假絲酵母菌（Candida albicans）Y0109、白假絲酵母菌SC5314、近平滑假絲酵母菌（Candida parapsilosis）、光滑假絲酵母菌（Candida glabrata）、新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）、石膏狀小孢子菌（Microsporum gypseum）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）、煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）等8株常見病原真菌為活性篩選菌株，進行抗真菌活性復(fù)篩，以篩選得到具有較強抗真菌活性的耐鹽內(nèi)生真菌。

1 ? 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1

藥材與試劑。受試菌株來源及編號見表1。

1.1.2

真菌培養(yǎng)基。RPMI 1640培養(yǎng)液組成為：RPMI 1640 10 g，嗎啉丙磺酸34.5 g，NaHCO₃2.0 g，三蒸水1 000 ml，在25 ℃下用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，雙層紗布過濾，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

YEPD培養(yǎng)液組成為：酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，三蒸水1 000 ml，2 ?mg/ml氯霉素50 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

SDA培養(yǎng)基（沙堡葡萄糖瓊脂）組成為：蛋白胨10 g，瓊脂18 g，葡萄糖40 g，三蒸水1 000 ml，2 mg/ml氯霉素50 ml，調(diào)pH至7.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PDA培養(yǎng)基組成為：土豆200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，水1 000 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，4 ?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3

供試樣品。前期篩選得到的11株抗稻瘟霉活性較強的菌株（D3、D4（Z）為非耐鹽內(nèi)生真菌，Z表示正丁醇層萃取物;5%-3、5%-5、5%-7、5%-8、5%-8（Z）、5%-9、5%-10（Z）、5%-11、5%-18）。

試劑及對照品有嗎啉啉丙磺酸（Sigma）;二甲基亞砜（DMSO，國藥集團）;瓊脂（BIOSHARP）;葡萄糖（天津市大茂化學(xué)試劑廠）;蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;酵母浸膏（上海西王淀粉糖有限公司）;氟康唑（FCZ，二軍大藥學(xué)院有機化學(xué)教研室）;ICZ（伊曲康唑，Sigma）;VCZ（立康唑，Sigma）;酮康唑（KCZ，二軍大藥學(xué)院有機化學(xué)教研室）;特比萘芬（TBF，上海醫(yī)工研究院）。

1.2 ? 方法

采用美國臨床實驗室標(biāo)準化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI即原NCCLS）M38A2^[6]和M27-A3^[7]文件推薦的微量液基稀釋法，進行抗真菌活性篩選，檢測供試品對假絲酵母菌和絲狀真菌的最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.1

供試品的配制。供試品均用DMSO溶解成6.4 mg/ml母液，-80 ℃保存。

1.2.2

陽性對照品的配制。氟康唑2 mg/ml（母液濃度為1 280 μg/ml）注射液，-80 ℃保存?zhèn)溆?用DMSO溶解伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬，分別制成6.4 mg/ml母液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3

藥敏板制備。在RPMI 1 640培養(yǎng)液中加入母液，充分振蕩，混勻，稀釋至640 μg/ml，備用。

1.2.4

MIC測定藥敏板制備。將50 μl供試品和陽性對照品母液（6.4 mg/ml）加入到1 ml深孔板中（含RPMI 1 640培養(yǎng)液450 μl），充分混勻;將160 μl氟康唑母液，加入到1 ml深孔板（含RPMI 1 640培養(yǎng)液340 μl）中，充分混勻，得各藥物濃度均為640 μg/ml測試液;10級倍比稀釋，使其分別成為640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg /ml 10個濃度的測試液。

分別取20 μl以上10個濃度的測試液，分裝于96孔板每排2～11號孔內(nèi)，制成藥敏板，薄膜密封，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5

真菌菌懸液制備。

1.2.5.1

酵母菌菌懸液制備。① 將受試菌株接種至SDA斜面，于30 ℃培養(yǎng)，活化2次;

②將活化好的菌株于SDA平皿上劃線接種，35 ℃培養(yǎng)24 h;

③選取菌落直徑>1 mm的菌落5個，溶解于滅菌后的三蒸水中，充分振蕩15 s，使其成為菌懸液;

④在SDA斜面上加適量RPMI 1640培養(yǎng)液，用吸管吹打斜面，四層無菌紗布過濾，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整菌懸液濃度至1×10⁶～5×10⁶CFU/ml（相當(dāng)于麥氏濁度0.5）。計算公式為：菌懸液濃度=5個方格內(nèi)細胞數(shù)×5×10⁴;

⑤用RPMI 1640培養(yǎng)液將上述菌懸液稀釋1 000倍，使其濃度在1×10³～5×10³CFU/ml之間。

1.2.5.2

絲狀真菌菌懸液制備。

①將受試菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，活化7 d，誘導(dǎo)分生孢子和孢囊孢子的形成;

②將濃度0.85%鹽水1 ml（含有0.01 ml Tween 20）加入活化好的菌落上，制備菌懸液;靜置3～5 min，使大顆粒完全沉淀后，取上層液體，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整菌懸液濃度至2×10⁶～1×10⁷CFU/ml，計算公式為：菌懸液濃度=5個方格內(nèi)孢子數(shù)×5×10⁴;

③用RPMI 1640培養(yǎng)液將上述菌懸液稀釋1 000倍，使其濃度在2×10³～1×10⁴CFU/ml之間。

1.2.6

接種。取藥敏板，每排1號孔為空白對照，加200 μl RPMI 1640培養(yǎng)液;12號孔作陽性對照，不加藥物，加200 μl新鮮配制的菌液;每排2～11號孔分別加180 μl菌液，供試品均10級4倍稀釋，使各孔的藥物最終濃度分別為64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1%;H排為質(zhì)控菌株近平滑念珠菌和氟康唑。

1.2.7

培養(yǎng)。各受試菌株采用不同條件的培養(yǎng)方法見表2。

1.2.8

結(jié)果判讀方法。

1.2.8.1

吸光度判斷法。用全自動酶標(biāo)儀檢測吸光度值。與陰性對照相比，吸光度值下降80%，即為藥物MIC。

1.2.8.2

肉眼判斷法。

讀取MIC值，在閱讀鏡輔助下，將各受試孔中真菌的生長情況與對照孔相比，進行評分。4分示表示生長無抑制;3分示代表生長輕微減少或相當(dāng)于對照品的75%;2分示表示生長明顯減少或相當(dāng)于對照品的50%;1分示表示輕微生長或相當(dāng)于對照品的25%;0分示表示未見生長或肉眼觀察澄清。

1.2.8.3

酵母菌。待篩選化合物MIC值判定為相當(dāng)于生長對照有50%或更多的生長減少時的最低藥物濃度（讀數(shù)為2）。

氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑和特比萘芬MIC值判定為相當(dāng)于生長對照有50%或更多的生長減少時的最低藥物濃度（讀數(shù)為2）。

1.2.8.4

絲狀真菌。供試品MIC值判定為生長相當(dāng)于對照品的50%或更多的生長減少時的最低藥物濃度（讀數(shù)為2）。

待篩選化合物MIC值判定為相當(dāng)于生長對照有50%或更多的生長減少時的最低藥物濃度（讀數(shù)為2）。

伏立康唑MIC值判定為沒有可見生長的最低藥物濃度（讀數(shù)為0）。

氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、特比萘芬MIC值判定為相當(dāng)于生長對照有50%或更多的生長減少時的最低藥物濃度（讀數(shù)為2）。

結(jié)果判定的步驟為：首先進行吸光度測定，判斷MIC，然后采用肉眼判定，以確認結(jié)果的可靠性。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2015年

1.2.8.5

質(zhì)量控制。每塊藥敏板第H行為質(zhì)控菌株和質(zhì)控化合物，其目的在于監(jiān)測藥敏試驗的準確度、精密度、所用試劑、測試條件以及儀器的情況，以保證試驗者的操作以及結(jié)果的準確客觀。質(zhì)控化合物采用氟康唑，質(zhì)控菌株采用近平滑念珠菌ATCC22019。

近平滑念珠菌ATCC22019 MIC參考值見表3。只有當(dāng)MIC值在下述范圍內(nèi)，方可認為試驗操作準確，試驗數(shù)據(jù)可靠。當(dāng)試驗菌株也生長良好時，可認為試驗成功，結(jié)果準確可靠。

2 ? 結(jié)果與分析

11種供試品對8株常見致病真菌的MIC值見表4。菌株5%-11對新隱有一定的抑制活性（MIC=32 μg/ml）。

表4 系列化合物對常見致病真菌體外活性

μg/ml

化合物Y0109SC5314近平22019新隱32609光滑537煙曲07544紅毛石小

D3>64>64>64>64>64>64>64>64

5%-3>64>64>64>64>64>64>64>64

D4（Z）>64>64>64>64>64>64>64>64

5%-5>64>64>64>64>64>64>64>64

5%-7>64>64>64>64>64>64>64>64

5%-8>64>64>64>64>64>64>64>64

5%-8（Z）>64>64>64>64>64>64>64>64

5%-9>64>64>64>64>64>64>64>64

5%-10（Z）>64>64>64>64>64>64>64>64

5%-11>64>64>6432>64>64>64>64

5%-18>64>64>64>64>64>64>64>64

ICZ111111≤0.1250.25

TBRL64>6420.540.25≤0.125≤0.125

KCZ≤0.125≤0.1250.250.50.254≤0.1251

VCZ≤0.125≤0.125≤0.125≤0.1250.250.25≤0.125≤0.125

FCZ≤0.1250.25221>64132

3 ? 討論

植物內(nèi)生真菌的次生代謝過程具有復(fù)雜性與靈活性，故而產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)新穎、具有獨立生物活性成分的物質(zhì)，緩解由植物資源短缺而引起的生態(tài)平衡紊亂。目前，關(guān)于藥用荒漠植物內(nèi)生真菌的研究較少，因而植物內(nèi)生真菌成為應(yīng)用前景非常廣闊的微生物資源。相關(guān)研究將有利于我國天然產(chǎn)物、生藥、微生物藥物的開發(fā)和稀有珍稀藥用植物資源的保護與利用。

該研究采用CLSI推薦的微量液基稀釋法，首次對荒漠植物牛心樸子內(nèi)生真菌及耐鹽內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物以白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、新生隱球菌、石膏狀小孢子菌、紅色毛癬菌、煙曲霉菌等8株常見病原真菌為活性篩選菌株，選擇初篩得到的11株抗稻瘟酶活性較強的內(nèi)生真菌發(fā)酵液萃取物進行抗真菌活性復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果表明，除了5%-11對新生隱球菌有抑制作用之外，其他10個萃取物的抗真菌活性均較弱。這可能與菌種的選擇有關(guān)。郭蕾等^[8]從粗疣合葉苔中分離得到內(nèi)生真菌47株，以稻瘟霉孢子形態(tài)異?；蛏L抑制為活性指標(biāo)，進行活性初步篩選，得到40株有活性的菌株，占總分離菌株的85.1%。經(jīng)過多次反復(fù)篩選得到活性較好的8株，進一步采用微量液基稀釋法，以白色念珠菌、新生隱球菌、紅色毛癬菌、薰煙曲霉菌作為受試菌株，考察8株菌的抗真菌活性，結(jié)果顯示大多菌株都有較好的抗病原真菌作用，且活性強于原植物本身。徐麗莉等^[9]從5年生園參和15年生移山參中分離得到內(nèi)生真菌48株，其中16株能完全抑

制稻瘟霉活性。采用微量液基稀釋法，以白色念珠菌、新生隱球菌、紅色毛癬菌、薰煙曲霉菌為受試菌株，對這16株菌株進行抗真菌活性檢測，其中11株有較好的抗真菌活性。后期研究擬更換病原真菌，進一步進行抗真菌活性的復(fù)篩，以尋找到活性較強的耐鹽內(nèi)生真菌，為替代資源研究奠定基礎(chǔ)。

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