農(nóng)桿菌介導(dǎo)創(chuàng)傷胚轉(zhuǎn)化的應(yīng)用

張麗君 劉龍龍 張建珍 孫毅 康國帥 周建平 崔林

摘要

[目的] 優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)創(chuàng)傷胚轉(zhuǎn)化的方法，提高轉(zhuǎn)化率，培育具有特定功能的轉(zhuǎn)基因品種，改善作物的生存能力和生態(tài)環(huán)境適應(yīng)力。[方法]參照農(nóng)桿菌劃胚介導(dǎo)植物萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化方法，以燕麥、玉米和高粱的萌發(fā)種子為試驗(yàn)材料，農(nóng)桿菌菌株LBA4404（含質(zhì)粒P3301ubiAc）侵染轉(zhuǎn)化燕麥、玉米和高粱的萌發(fā)種子，優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，探索燕麥、玉米和高粱遺傳轉(zhuǎn)化體系，探討菌液濃度、種子萌發(fā)時(shí)間、超聲波功率、乙酰丁香酮和草丁膦濃度對(duì)3種作物的影響并進(jìn)行比較分析。[結(jié)果]農(nóng)桿菌菌液濃度為0.6>OD600≥0.4 時(shí)轉(zhuǎn)化效果最佳;第1次超聲波功率為900 W，處理時(shí)間為10 min;第2次超聲波功率為200 W，處理時(shí)間為4 min效果最佳。轉(zhuǎn)化效率最高;添加乙酰丁香酮對(duì)燕麥、高粱和玉米的發(fā)芽有明顯促進(jìn)作用，但轉(zhuǎn)化效果有明顯區(qū)別;燕麥、玉米和高粱的轉(zhuǎn)化植株對(duì)草丁膦的耐受性差異不大，與非轉(zhuǎn)化植株相比，0.8 mg/L 除草劑脅迫下燕麥、玉米和高粱種子萌發(fā)受到一定程度的抑制。用1 mg/L 除草劑溶液對(duì)T₀和T₁代轉(zhuǎn)化植株幼苗進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)化植株的存活率高于對(duì)照。[結(jié)論]經(jīng)除草劑篩選和PCR對(duì)T₀和T₁代幼苗檢測，初步證明獲得了轉(zhuǎn)化植株。

關(guān)鍵詞 植物轉(zhuǎn)化;燕麥;玉米;高粱

中圖分類號(hào) S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2015）03-025-04

Trauma Embryo of Genetic Transformation System with Agrobacterium Mediated Method

ZHANG Lijun1，2， LIU Longlong¹，ZHANG Jianzhen²， CUI Lin1* et al

（1. Crop germplasm resources research institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau， Ministry of Agriculture， P. R. China， Taiyuan， Shanxi ?030031;2. Research Institute of Applied Biology，Shanxi University，Taiyuan，Shanxi ?030001）

Key words [Objective]The purpose was to optimize agrobacteriummediated plant germination seed transformation method，increase conversion rate， breed GM varieties with specific functions， and improve viability and adaptability of crops. [Method]This paper consulted agrobacteriummediated plant germination seed transformation method and selected germinating seeds of oat， maize and sorghum as test materials. Germinating seeds of oat， maize and sorghum were infected and transformed by agrobacterium strain， which included plasmid P3301ubiAc. Transformation conditions were optimized. Genetic transformation systems of oat， maize and sorghum were studied. Concentration of bacterium， seed germinating time， ultrasonic power， and influence of concentration of acetosyringone and glufosinate on the above three crops were compared and analyzed. [Result]The experiment showed that when 0.6>OD600≥0.4， transformation achieved the best effect; Ultrasonic power was 900 W at the first time and treatment time was 10 minutes; Ultrasonic power was 200 W at the second time and transformation achieved the best effect when treatment time was 4 minutes; Acetosyringone could affect germination of oat， sorghum and maize significantly. It could increase transformation rate of maize and lower that of sorghum， but for oat， its effect was not obvious; in terms of tolerance to glufosinate， the difference was not significant among transformed plants of oat， maize and sorghum. Compared with nontransformed plants， seed germination of oat， maize and sorghum were restrained to some degree under the stress of 0.8 mg/L herbicide solution. With 1 mg/L herbicide solution to select seedlings of T₀ and T₁ transformed plants， the result showed survival rates of transformed plants is higher than those of control group. [Conclusion ]After herbicide selection and PCR test on T₀ and T₁ seedlings， it was proved preliminarily that transformed plants were got.

Key words Plant transformation;Oat;Maize;Sorghum

基金項(xiàng)目 國家燕麥?zhǔn)w麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS08A1）;山西省農(nóng)科院博士基金項(xiàng)目（YBSJJ209）。

作者簡介

張麗君（1981-），女，河北行唐人，助理研究員，博士，從事燕麥遺傳育種研究。*通訊作者 。

收稿日期 20141203

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，植物基因工程在農(nóng)作物品種改良中的應(yīng)用越來越受到人們的重視，利用植物基因工程改良植物品質(zhì)、增強(qiáng)抗性等是一種行之有效的方法，以彌補(bǔ)常規(guī)育種技術(shù)的不足，縮短育種周期。因此利用基因工程育種技術(shù)可加速選育出優(yōu)質(zhì)、抗逆的轉(zhuǎn)基因新品種，滿足山西高原生態(tài)建設(shè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)種子萌發(fā)的方法^[1]是以植物萌發(fā)種子為受體，在種子萌發(fā)過程中對(duì)受體植物萌發(fā)種子生長點(diǎn)部位進(jìn)行微創(chuàng)，借助于超聲波的生物學(xué)效應(yīng)，引起細(xì)胞壁和質(zhì)膜的破損或可逆的質(zhì)膜透性改變，為細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生物質(zhì)交換創(chuàng)造條件。萌發(fā)的種子經(jīng)過超聲波處理后，立即轉(zhuǎn)移到攜帶外源基因片段的農(nóng)桿菌中進(jìn)行共培養(yǎng)，將外源基因轉(zhuǎn)移到受體基因組中，并通過對(duì)種子或幼苗的直接篩選，對(duì)植株葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Southern雜交，進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化株。筆者以燕麥、玉米、高粱的種子作為外植體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)種子萌發(fā)的方法，進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?植物材料及供體質(zhì)粒

植物材料為燕麥品燕2號(hào)、玉米昌7-2、 高粱晉雜5號(hào)，種子預(yù)先精選備用。質(zhì)粒載體為P3301ubiAc的Cry1Ac基因;啟動(dòng)子為Ubi，終止子為Nos（圖1）， 農(nóng)桿菌菌株是LBA4404。標(biāo)記基因?yàn)榭敲顾兀↘m），篩選基因?yàn)镵m和鏈霉素（Streptomyces hygroscopicus）。菌株基因組中包含一個(gè)抗除草劑標(biāo)記基因Bar基因。Bar 基因編碼草丁膦乙酰 CoA 轉(zhuǎn)移酶（ PAT） ，可催化草丁膦（ PPT） 的自由氨基乙?；?，從而使除草劑草丁膦失活。植物特別是單子葉植物對(duì) Bar 基因編碼的 PAT 酶作用的底物 PPT 內(nèi)源抗性較低，且Bar基因表達(dá)檢測方法較簡便，因而Bar基因也被廣泛用作植物基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的選擇性標(biāo)記基因和分子生物學(xué)研究的報(bào)告基因。

圖1 ?質(zhì)粒p3301ubiAc的物理圖譜

1.2 農(nóng)桿菌的制備

取含有質(zhì)粒P3301ubiAc的農(nóng)桿菌菌株LBA4404單菌落接種于濃度50 mg/L Km和100 mg/L的鏈霉素LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌液培養(yǎng)，OD600分別設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8備用（臨時(shí)放置于4 ℃保存）。

1.3 種子萌發(fā)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

將種子于0.1% 氯化汞浸泡2 min左右，70%乙醇浸泡10 min左右滅菌;最后用無菌水漂洗3～5次以上，消毒后的種子進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為4、12、20 h，每個(gè)處理用100粒種子，重復(fù)3次。于搖床上（120 r/min）28 ℃培養(yǎng)，讓種子充分吸水膨脹。

1.4 超聲波處理對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

超聲波處理分為2次：微創(chuàng)傷后進(jìn)行第一次超聲波處理，工作頻率設(shè)置4個(gè)處理，分別為0（CK）、300、600、900 W;工作時(shí)間設(shè)置3個(gè)處理，分別為0（CK）、5、10 min，每個(gè)處理含200粒種子，重復(fù)3次;第1次超聲波處理后的微創(chuàng)傷種子浸泡在含有目的基因農(nóng)桿菌菌液中進(jìn)行第2次超聲波處理，工作頻率設(shè)置4個(gè)處理，分別為0（CK）、100、200、300 W;工作時(shí)間設(shè)置3個(gè)處理，分別為0（CK）、4、8 min。

1.5 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

將第2次超聲處理后的微創(chuàng)傷種子浸泡在含有目的基因農(nóng)桿菌菌液中，于搖床上振蕩（120 r/min）培養(yǎng)1～3 d，并在種胚露白后停止振蕩培養(yǎng);將露白種子先用無菌水漂洗3～5次，然后播種大田中，記錄播種種子的顆粒數(shù)和出苗情況。

1.6 不同植物種子的除草劑耐受試驗(yàn)

在生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，培養(yǎng)液和補(bǔ)給液均為草丁膦溶液。草丁膦濃度設(shè)置為0.8、0.6、0.4、0.2 mg/L和8、6、4、2 mg/L，每個(gè)處理20粒種子，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。14 d后觀察種子萌發(fā)以及出芽情況。將共培養(yǎng)后的材料種植在大田中，到幼苗成長至4～5葉期噴霧草丁膦溶液進(jìn)行除草劑篩選。7 d后調(diào)查成活苗數(shù);20 d后再次噴霧草丁膦溶液進(jìn)行篩選，7 d后調(diào)查成活苗數(shù)，成活苗可以初步認(rèn)定為草丁膦抗性苗。在1 mg/L草丁膦存活的植株經(jīng)自交收獲種子，每個(gè)作物選500粒種子，第2年大田播種，以未轉(zhuǎn)化種子同期播種作為對(duì)照，各品種五葉期用1 mg/L草丁膦對(duì)其進(jìn)行噴灑，7 d后調(diào)查成活苗數(shù)。

1.7 ?PCR檢測

采用CTAB法^[2]提取總DNA，引物Primer1：5′CTGACCGTGACCGTGCTG3′;Primer2：5′TGGTGCCGTAGGCGAACT3′，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，于72 ℃延伸10 min ，產(chǎn)物片段長度為500 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

將試驗(yàn)菌液濃度OD600設(shè)置為0.2、0.4、0.6和0.8。從表1可以看出，不同生長時(shí)期的農(nóng)桿菌都具有轉(zhuǎn)化能力，但轉(zhuǎn)化效率有一定差別。0.4﹥OD600≥0.2時(shí)，農(nóng)桿菌還處于生長期，濃度過低，對(duì)其的侵染程度有限。當(dāng)農(nóng)桿菌生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，微創(chuàng)傷傷口自我修復(fù)完成。當(dāng)0.6﹥OD600≥0.4時(shí)種子的轉(zhuǎn)化率最高，此階段農(nóng)桿菌尚未達(dá)到對(duì)數(shù)生長期的旺盛期，在與種子的共培養(yǎng)階段，農(nóng)桿菌仍處于對(duì)數(shù)生長期并很快達(dá)到旺盛期，此時(shí)微創(chuàng)傷傷口也未完成自我修復(fù)，從而促進(jìn)TDNA轉(zhuǎn)移和整合到宿主植物基因組中;而當(dāng)OD600≥0.6時(shí)，轉(zhuǎn)化率有所降低，由于菌液濃度已達(dá)到旺盛的對(duì)數(shù)生長期，在種子的共培養(yǎng)階段菌液的濃度仍在增長并很快達(dá)到飽和狀態(tài)，達(dá)到飽和狀態(tài)的農(nóng)桿菌不利于TDNA轉(zhuǎn)移和整合到宿主植物的基因組中。由此可知，當(dāng)農(nóng)桿菌生長快達(dá)到對(duì)數(shù)生長期（0.6﹥OD600≥0.4） 時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高。

表1 菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

%

菌液濃度（OD600）燕麥高粱 ?玉米

0.4﹥OD600≥0.22.55.43.1

0.6﹥OD600≥0.47.014.99.2

0.8﹥OD600≥0.63.88.95.3

OD600≥0.81.66.12.7

2.2 種子萌發(fā)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

從表2可以看出，燕麥的種子較小，種皮吸脹時(shí)間短，故萌發(fā)時(shí)間不宜太長，4 h轉(zhuǎn)化率最高，為最佳時(shí)間。玉米種子較大，8 h轉(zhuǎn)化率最高。

表2 ?種子萌發(fā)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

%

種子萌發(fā)時(shí)間∥h燕麥高粱玉米

452.3838.7317.64

636.7962.1431.92

812.1321.1749.38

43卷3期 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 張麗君等 農(nóng)桿菌介導(dǎo)創(chuàng)傷胚轉(zhuǎn)化的應(yīng)用

2.3 超聲波對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

將第1次超聲波功率分別設(shè)置為0（CK）、300、600、900 W，結(jié)果表明，燕麥、高粱和玉米表現(xiàn)結(jié)果相一致，在第1次超聲波處理時(shí)，超聲波功率為300 W時(shí)種子的出芽率最高，隨著功率的增加而降低，可能是由于超聲波可以促進(jìn)種子萌發(fā)，促使種子細(xì)胞的細(xì)胞壁和原生質(zhì)發(fā)生水合，加速原生質(zhì)從凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z狀態(tài)。各種酶開始活化，呼吸和代謝作用急劇增強(qiáng)。超聲波功率為900 W和0時(shí)，種子的發(fā)芽率接近，說明相對(duì)較低的超聲波功率對(duì)種子發(fā)芽率有促進(jìn)作用。而轉(zhuǎn)化率則相反，隨著超聲波功率的增加，轉(zhuǎn)化率隨之提高（表3），說明超聲波的空化作用對(duì)促進(jìn)TDNA轉(zhuǎn)移和整合到宿主植物基因組都有明顯的促進(jìn)作用，超聲波處理功率為900 W時(shí)，處理時(shí)間10 min對(duì)萌發(fā)種子的轉(zhuǎn)化率最高。第1次超聲波處理后，加入農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行第2次超聲波處理。第2次超聲波處理設(shè)置為0（CK）、100、200、300 W;工作時(shí)間設(shè)置3個(gè)處理，分別為0（CK）、4、8 min。第2次超聲波處理功率的對(duì)照（CK）設(shè)置為第一次超聲波處理功率900 W處理后的種子。超聲波處理本身會(huì)對(duì)農(nóng)桿菌造成一定傷害，因此選擇低濃度的超聲波功率對(duì)其進(jìn)行處理，結(jié)果表明，第2次超聲波功率對(duì)燕麥、玉米和高粱的轉(zhuǎn)化率都有促進(jìn)作用。超聲波功率為200 W時(shí)，處理時(shí)間4 min對(duì)轉(zhuǎn)化效果最佳。

表3 ? 第1次超聲波對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

%

超聲波強(qiáng)度

W

燕麥

出芽率轉(zhuǎn)化率

高粱

出芽率轉(zhuǎn)化率

玉米

出芽率轉(zhuǎn)化率

09.331.259.3019.609.313.57

30014.5832.9514.1044.3014.1739.87

60012.0759.4913.6886.7013.9862.15

9009.1389.839.8091.508.9788.72

2.4 乙酰丁香酮對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

植物傷口處的細(xì)胞分泌大量的酚類化合物、中性糖，酚類化合物如乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HO-AS）等，一些中性糖如L-阿拉伯糖、D-木糖等，上述物質(zhì)既是根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又是農(nóng)桿菌中毒性基因Vir表達(dá)的誘導(dǎo)物，在它們的作用下，導(dǎo)致T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。作為主要誘導(dǎo)物的AS和HO-AS等酚類物質(zhì)，主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，所以在轉(zhuǎn)化過程中人為添加AS 可以促進(jìn)根癌農(nóng)桿菌感染單子葉植物^[3-4]。在不同超聲波功率處理后，將AS添加到共培養(yǎng)液中，AS對(duì)萌動(dòng)種子劃胚處理后轉(zhuǎn)化率的影響見表4。由表4可知，與超聲波處理后未添加AS相比，在共培養(yǎng)液中加入100 μmol/L乙酰丁香酮3種作物種子出芽率明顯提高，但轉(zhuǎn)化率3種作物表現(xiàn)不同，燕麥中添加AS無明顯變化，玉米的轉(zhuǎn)化率有所提高，高粱的轉(zhuǎn)化率反而降低?？赡苡捎?種作物對(duì)AS濃度要求不同，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率不同。

2.5 共培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌中TDNA攜帶外源基因進(jìn)入植物細(xì)胞的關(guān)鍵時(shí)期，此過程發(fā)生之后，農(nóng)桿菌的繼續(xù)存在已沒有必要，且微創(chuàng)傷傷口也完成了自我修復(fù)。由于轉(zhuǎn)化材料為種子，需要考慮種子的發(fā)芽情況，共培養(yǎng)時(shí)間以2 d較合適。共培養(yǎng)時(shí)間太短，農(nóng)桿菌沒有充分地對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率較低。而共培養(yǎng)時(shí)間太長，胚細(xì)胞呼吸作用逐漸加強(qiáng)，酶的活動(dòng)逐漸旺盛，加速消耗氧氣，使得共培養(yǎng)液中氧氣含量減少，營養(yǎng)情況不良并容易產(chǎn)生、大量積累次級(jí)代謝產(chǎn)物，可能產(chǎn)生有害物質(zhì)。另外，種子發(fā)芽在移栽過程中會(huì)造成大批量種子受傷死亡。

2.6 ?除草劑對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

從表5可以看出，在0.8 mg/L草丁膦的脅迫下，燕麥、玉米和高粱的種子只有52%、61%和43%能夠萌發(fā)，與對(duì)照相比，萌發(fā)緩慢。在2 mg/L草丁膦脅迫下，有33%、45%和37%的種子仍能夠緩慢萌發(fā)，但已不能正常生長。大田噴霧試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，選用1 mg/L的草丁膦對(duì)其進(jìn)行噴灑試驗(yàn)，第1次噴灑草丁膦溶液后，對(duì)照植株有少量存活，第2次噴灑草丁膦溶液7 d后，對(duì)照幾乎全部死亡。第2年各作物五葉期用1 mg/L草丁膦對(duì)其進(jìn)行噴灑試驗(yàn)，從表6可以看出，T₁代轉(zhuǎn)化植株生長早期噴灑草丁膦后各作物存活率明顯高于T₀代，達(dá)50%以上。

2.7 PCR檢測

對(duì)經(jīng)草丁膦篩選的抗性植株提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以提取的抗性植株DNA作為模板，用Cry1AC基因一對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR特異片段的擴(kuò)增，以未轉(zhuǎn)化植株作為陰性對(duì)照，以質(zhì)粒DNA作為陽性對(duì)照，進(jìn)行PCR檢測。其中部分株系與陽性對(duì)照擴(kuò)增出的條帶完全相同，而對(duì)照DNA則未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，初步說明外源基因已導(dǎo)入植株中（圖2）。

3 ?結(jié)論與討論

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化過程中進(jìn)行超聲波處理，利用超聲波的空化作用在外植體的表面和深層形成許多的微傷口，大量微傷口的存在為農(nóng)桿菌的感染提供了更多的機(jī)會(huì)，使外源基因容易進(jìn)入，促進(jìn)TDNA轉(zhuǎn)移和整合到宿主植物的基因組中，提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化活力^[5]。但超聲波處理時(shí)間不宜太長，由于超聲波的熱化作用，使超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)，所產(chǎn)生的能量會(huì)不斷地被介質(zhì)吸收而使介質(zhì)的溫度升高^[6] ，從而對(duì)外植體造成傷害。Santarem 等^[7]、Trick等^[8] 用掃描隧道顯微鏡觀察到經(jīng)過超聲波處理的大豆子葉的表面和深層存在大量的微傷口，處理時(shí)間越長，外植體的損傷越嚴(yán)重，因此在實(shí)際利用時(shí)需要測定超聲波處理的強(qiáng)度和時(shí)間。在該研究中前后2次使用超聲波處理，第1次超聲波處理的目的是使種子經(jīng)過超聲波處理后處于一種“感受態(tài)”的狀態(tài)，有利于促進(jìn)T-DNA轉(zhuǎn)移和整合到宿主植物的基因組中，提高基因的轉(zhuǎn)化率。第2次超聲波處理的目的是使帶有目的基因的菌在超聲波處理時(shí)處于一種“避難”行為當(dāng)中，從而加快T-DNA轉(zhuǎn)移和整合到宿主植物的基因組中。第1次超聲波處理功率900 W，處理時(shí)間為10 min，第2次超聲波功率為200 W時(shí)，處理時(shí)間為4 min時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)化效果最佳。

轉(zhuǎn)基因植物的研究目的主要在于改善植物抗逆、抗除草劑等性質(zhì)，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，作為生物反應(yīng)器等方面^[9]。目前我國轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和林木有22種，轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)入的性狀以抗除草劑為多，約超過40%，其次為抗蟲、抗病毒和抗逆性等性狀^[10]。在禾本科作物中，玉米建立了良好的遺傳轉(zhuǎn)換體系，具有外源基因單拷貝插入、遺傳穩(wěn)定、無載體骨架插入、目的基因表達(dá)合適、對(duì)玉米自身性狀無影響等特點(diǎn)。國外大公司及部分公立研究機(jī)構(gòu)建立了相對(duì)成熟的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。全球 1.77 億hm²玉米種植面積中有 32%是轉(zhuǎn)基因玉米^[11]。國內(nèi)玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系研究起步較晚，初步建立了玉米規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系。與玉米相比，高粱轉(zhuǎn)基因研究工作相對(duì)滯后，遺傳轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化效率偏低、外源基因表達(dá)量低或不表達(dá)。高粱的未成熟胚、幼穗、莖尖以及來自未成熟胚或幼穗經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織均是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，可采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電激法、花粉管通道法、顯微注射法和原生質(zhì)體化學(xué)（PEG）處理法等方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化^[12]。相比之下，燕麥的轉(zhuǎn)基因處于落后狀態(tài)，目前國內(nèi)外成功轉(zhuǎn)化于燕麥的基因有大麥的HVA1（甲肝外殼蛋白）基因^[13]，抗除草劑Bar基因^[14]和PPIP基因

（類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白基因）^[15]。而國內(nèi)報(bào)道的只有張

藝^[15]和王迅婧^[16]均獲得了轉(zhuǎn)化植株，但均未確定外源基因在后代中能否穩(wěn)定表達(dá)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)種子萌發(fā)方法的優(yōu)點(diǎn)是外植體來源不受時(shí)間限制，不需要建立植株再生體系，免去組織培養(yǎng)等復(fù)雜的操作。目前在玉米^[17]、大豆^[18]、高粱^[19]等作物均獲得了轉(zhuǎn)基因植株，但在作物上應(yīng)用還不夠成熟^[20]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)種子萌發(fā)方法的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化過程中的影響因素仍需進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)運(yùn)用植物萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化法對(duì)燕麥、高粱和玉米3種作物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，建立了該方法基本的遺傳轉(zhuǎn)化條件，并對(duì)3種作物的萌發(fā)時(shí)間、菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、超聲波功率、乙酰丁香酮濃度、草丁膦的敏感性進(jìn)行了比對(duì)，優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)種子萌發(fā)的方法，提高轉(zhuǎn)化效率。隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)種子萌發(fā)方法的改進(jìn)、轉(zhuǎn)化效率的提高，農(nóng)桿菌介導(dǎo)種子萌發(fā)的方法將為作物分子育種和基因功能研究提供有力的方法保障。

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