氯沙坦對小鼠前腦缺血再灌后期腦損傷的保護作用

馬云鵬 喬圓 廖雁 牛拴成 梁月琴 黃凌岸 張振 范彥英 張軒萍

摘要：目的研究AT1受體阻斷劑氯沙坦對小鼠前腦缺血再灌后期的神經(jīng)保護作用。方法將成年雄性昆明小鼠隨機分為對照組、前腦缺血組、前腦缺血+氯沙坦給藥組及氯沙坦單純給藥組，通過阻斷雙側頸總動脈60 min建立前腦缺血模型，氯沙坦于缺血前14 d至再灌后20 d，每日腹腔注射1 mg/kg。比較再灌后不同時間點各組小鼠的體重和在水迷宮實驗中的學習記憶能力差異。再灌21 d，對各組小鼠取腦、冰凍切片、進行甲苯胺藍染色，觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷情況。結果前腦缺血組小鼠再灌1 d體重即下降，再灌3 d下降程度達到最大，氯沙坦可顯著提高缺血小鼠再灌3 d、7 d、14 d及21 d的體重恢復程度。再灌16 d進行水迷宮實驗，前腦缺血組小鼠與對照組相比，訓練第3天和第4天的平臺潛伏期顯著延長，而氯沙坦可顯著縮短缺血小鼠的平臺潛伏期。再灌21 d，前腦缺血組小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度顯著低于對照組，而氯沙坦顯著抑制了神經(jīng)元的缺失。結論 AT1受體阻斷劑氯沙坦對小鼠前腦缺血的長期再灌注損傷具有保護作用。

關鍵詞：前腦缺血;神經(jīng)損傷;AT1受體阻斷劑

中圖分類號：R743.3R285.5文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.16721349.2015.01.021文章編號：1672

1349（2015）01005803

腦卒中目前除缺血后短時間內(nèi)進行溶栓外，尚無較好的治療手段[1]。AT1受體阻斷劑，又稱血管緊張素Ⅱ受體1亞型阻斷劑（angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers），是目前最常用的高血壓一線治療藥物之一。Lutterotti等最早在給予8% NaCl飲用的Dahl鹽敏感大鼠上發(fā)現(xiàn)，給予AT1受體阻斷劑氯沙坦能夠暫時減少腦卒中的發(fā)生和進展[2]。Dai等[3]在大鼠局灶性腦缺血模型上發(fā)現(xiàn)，缺血前5 d側腦室注射AT1受體阻斷劑厄貝沙坦，可以顯著改善腦缺血再灌24 h后的神經(jīng)功能。隨后，研究者還在全腦缺血、永久性局灶性腦缺血及培養(yǎng)的神經(jīng)元OGD等多種腦缺血模型上，驗證了AT1受體阻斷劑對腦缺血損傷的神經(jīng)保護作用[47]。但是，目前這些研究主要評價了AT1受體阻斷劑對腦缺血早期（7 d以內(nèi)）的保護作用，但尚不明確其對腦缺血后期（數(shù)周）的學習記憶功能及神經(jīng)損傷的影響。

本課題擬利用小鼠雙側頸總動脈結扎引起的前腦缺血模型[8]，研究臨床上常用的AT1受體阻斷劑氯沙坦對腦缺血再灌后期學習記憶功能及神經(jīng)元損傷的作用。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性昆明小鼠24只，體重30 g～35 g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心。所有的動物實驗均遵照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，動物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境（22℃）中，12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。

1.2實驗方法

1.2.1分組及給藥方法將動物隨機分為對照組（Control）、前腦缺血組（Bccao）、前腦缺血+氯沙坦給藥組（Bccao+Losartan）和氯沙坦單純給藥組（Losartan）。氯沙坦于缺血前14 d至再灌后20 d，每日腹腔注射1 mg/kg。對照組和缺血組則給予生理鹽水。

1.2.2前腦缺血模型制備以4%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，頸部正中切口，鈍性分離出左右兩側頸總動脈，用縫線（60）結扎以阻斷雙側頸總動脈血流，缺血60 min后恢復血流，并縫合創(chuàng)口。對照組及氯沙坦單純給藥組僅分離但不結扎雙側頸總動脈。術后動物能自主活動前利用小動物保溫箱維持肛溫在36.5 ℃～37.5 ℃。

1.2.3體重監(jiān)測為評價小鼠腦缺血再灌損傷的程度，于手術前1 d及術后1 d、3 d、7 d、14 d及21 d對小鼠體重進行監(jiān)測，并做記錄。

1.2.4Morris水迷宮實驗再灌16 d，利用水迷宮實驗評價小鼠的空間學習記憶能力。參照文獻[9]，水池中分為四個對稱象限Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，在池邊有不同的可見圖案作為標志。水迷宮測試共5 d。前4 d為記憶獲得階段，在該階段，將平臺放于第1象限水下的固定位置;每天將每只小鼠分別由4個對稱象限的預定位置，頭向外側放入水中，直到小鼠找到水下的平臺并在上面停留超過5 s，則記錄下小鼠尋找平臺的時間，即平臺潛伏期。測定時間最長為60 s。5 d時為測試階段，在此階段，撤去平臺，將小鼠由Ⅱ、Ⅲ象限放入水中，測試小鼠在第1象限內(nèi)的停留時間。實驗通過攝像頭錄像，并通過輔助圖像分析軟件進行分析。

1.2.5病理切片及甲苯胺藍染色前腦缺血再灌21 d，以4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，經(jīng)左心室插管灌流。灌流液依次采用生理鹽水及4%多聚甲醛固定液。后固定，分別用15%和30%的蔗糖溶液進行脫水。制備厚度為16 μm的海馬冠狀切片。染色時以0.01 mol/L PBS洗5 min，重復3次;1%甲苯胺藍染色30 min;0.5%鹽酸酒精分化（3～10）s;95%、100%乙醇脫水各2 min，各重復兩次;二甲苯透明，封片。對海馬CA1區(qū)的正常神經(jīng)元進行計數(shù)。

1.3統(tǒng)計學處理計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。采用SPSS 15.0軟件處理，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）。P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1氯沙坦對小鼠前腦缺血再灌后不同時間點體重變化的影響前腦缺血再灌1 d，小鼠體重出現(xiàn)了下降（見圖1），但組間的體重下降程度尚無明顯差異。前腦缺血組小鼠再灌3 d體重下降程度達到最大，再灌14 d體重恢復至缺血前水平;給予氯沙坦可顯著提高缺血小鼠再灌3 d、7 d、14 d、21 d的體重恢復程度。氯沙坦單純給藥組小鼠體重增加的程度與對照組相比無統(tǒng)計學意義。

2.2氯沙坦對小鼠前腦缺血再灌后期空間學習記憶能力的影響在學習記憶獲得階段的1 d，各組平臺潛伏期并無明顯差異（見圖2）。隨著訓練天數(shù)的增加，對照組的平臺潛伏期逐漸縮短。與對照組相比，前腦缺血組小鼠的學習記憶獲得能力顯著受損傷，表現(xiàn)為訓練第3 天和第4 天平臺潛伏期顯著延長。而前腦缺血+氯沙坦給藥組在訓練第3天和第4天平臺潛伏期均顯著短于前腦缺血組，提示氯沙坦顯著改善了小鼠前腦缺血再灌后期學習記憶的獲得能力。另外，氯沙坦單純給藥組在學習記憶獲得階段的平臺潛伏期與對照組相比無統(tǒng)計學意義。在測試階段，各組小鼠在第Ⅰ象限的停留時間都沒有統(tǒng)計學意義（見圖3），前腦缺血及給予氯沙坦并未對成學習記憶的保持能力造成明顯影響。

2.3氯沙坦對小鼠前腦缺血再灌后期海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的影響甲苯胺藍染色結果顯示（見圖4），前腦缺血組小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度與對照組相比，下降了（38.04±14.27）%（P<0.01）;而給予氯沙坦明顯抑制了前腦缺血再灌引起的CA1區(qū)神經(jīng)元缺失（P<0.05）。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)AT1受體阻斷劑對小鼠前腦缺血的長期再灌注損傷具有保護作用，表現(xiàn)為再灌后體重恢復加快、空間學習記憶能力改善以及神經(jīng)元損傷減輕。AT1受體阻斷劑對腦缺血再灌早期的神經(jīng)損傷具有保護作用[1012]。腦缺血后動物體重下降的程度可以部分反映缺血再灌損傷的嚴重程度[13，14]。氯沙坦不僅可明顯促進前腦缺血再灌后3 d和7 d的體重恢復，對再灌后期（14 d 和21 d）的體重恢復也有促進作用。對正常小鼠的體重變化并無影響。該藥物對腦缺血再灌早期和后期的神經(jīng)損傷可能均具有保護作用。氯沙坦對小鼠腦缺血再灌后期海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷具有較強的保護作用。腦缺血再灌注引發(fā)神經(jīng)元損傷，往往同時伴隨著學習記憶功能的下降[15]。大劑量氯沙坦（10 mg/kg）對正常小鼠學習記憶能力有提高作用[16]。連續(xù)多日給予正常小鼠小劑量的氯沙坦（1 mg/kg），對其空間學習記憶的獲得能力并無明顯改善作用。然而，該劑量下的氯沙坦可明顯改善小鼠前腦缺血再灌16 d后的空間學習記憶的獲得能力。氯沙坦對腦缺血再灌后期的神經(jīng)元損傷和學習記憶功能均具有明顯的改善作用。

AT1受體阻斷劑氯沙坦具有抗腦缺血再灌后期損傷的作用。由于該藥物在腦缺血再灌后的不同階段均具有明顯的神經(jīng)保護作用，該藥物有望應用于對缺血性腦卒中特別是伴有高血壓患者的治療，但其具體機制還有待更深入的研究。

參考文獻：

[1]Zhang LF，Yang J，Hong Z，et al.Proportion of different subtypes of stroke in China[J].Stroke，2003，34（9）：20912096.

[2]von Lutterotti N，Camargo MJ，Campbell WG，et al.Angiotensin II receptor antagonist delays renal damage and stroke in saltloaded Dahl saltsensitive rats[J].J Hypertens，1992，10（9）：949957.

[3]Dai WJ，F(xiàn)unk A，Herdegen T，et al.Blockade of central angiotensin AT1 receptors improves neurological outcome and reduces expression of AP1 transcription factors after focal brain ischemia in rats[J].Stroke，1999，30（11）：23912399.

[4]Sugawara T，Kinouchi H，Oda M，et al.Candesartan reduces superoxide production after global cerebral ischemia[J].Neuro Report，2005，16（4）：325328.

[5]Kobayashi T，Kawamata T，Shibata N，et al.Angiotensin II type 1 receptor blocker telmisartan reduces cerebral infarct volume and periinfarct cytosolic phospholipase A2 Level in experimental stroke[J].J ?Neurotrauma，2009，26（12）：23552364.

[6]Wu X，Kihara T，Hongo H，et al.Angiotensin receptor type 1 antagonists protect against neuronal injury induced by oxygenglucose depletion[J].Br J Pharmacol，2010，161（1）：3350.

[7]Zhang TL，F(xiàn)u JL，Geng Z，et al.The neuroprotective effect of losartan through inhibiting AT1/ASK1/MKK4/JNK3 pathway following cerebral I/R in rat hippocampal CA1 region[J].CNS Neuroscience & Therapeutics，2012，18（12）：981987.

[8]Ginsberg MD，Busto R.Rodent models of cerebral ischemia[J].Stroke，1989，29（12）：627642.

[9]Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J].Nat Protoc，2006，1（2）：848858.

[10]Faure S，Bureau A，Oudart N，et al.Protective effect of candesartan in experimental ischemic stroke in the rat mediated by AT2 and AT4 receptors[J].J Hypertension，2008，26（10）：20082015.

[11]Sugawara T，Kinouchi H，Oda M，et al.Candesartan reduces superoxide production after global cerebral ischemia[J].Neuro Report，2005，16（4）：325328.

[12]Lou M，Blume A，Zhao Y，et al.Sustained blockade of brain AT1 receptors before and after focal cerebral ischemia alleviates neurologic deficits and reduces neuronal injury，apoptosis，and inflammatory responses in the rat[J].Cerebral Blood Flow & Metabolism，2004，24（5）：536547.

[13]Papas S，Crepel V，Hasboun D，et al.Cycloheximide reduces the effects of anoxic insult in vivo and in vitro[J].Eur J Neurosci，1992，4（8）：758765.

[14]Zhang F，Wang S，Signore AP，et al.Neuroprotective effects of leptin against ischemic injury induced by oxygenglucose deprivation and transient cerebral ischemia[J].Stroke，2007，38（8）：23292336.

[15]Soares LM，Schiavon AP，Milani H，et al.Cognitive impairment and persistent anxietyrelated responses following bilateral common carotid artery occlusion in mice[J].Behav Brain Res，2013，249：2837.

[16]Raghavendra V，Chopra K and Kulkarni SK.Involvement of cholinergic system in losartaninducedfacilitation of spatial and shortterm working memory[J].Neuropeptides，1998，32（5）：417421.

（收稿日期：20140328）

（本文編輯王雅潔）