早期腦利鈉肽后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷和高遷移率族蛋白1表達(dá)的影響

黃星月 胡鋼英 黃婷婷 謝箐 李丹 胡笑容 江洪

摘要 目的檢測(cè)高遷移率族蛋白1（HMGB1）在大鼠心肌中的表達(dá)，驗(yàn)證腦利鈉肽（BNP）后處理是否能夠減少心肌損傷。方法給予麻醉后的大鼠30 min心肌缺血，再灌注前靜注BNP15 min，然后再灌注4 h。記錄乳酸脫氫酸（LDH）、心肌磷酸激酶（CK），腫瘤壞死因子α（TNFα），白介素（IL6）等指標(biāo)的變化，通過免疫印跡法評(píng)估HMGB1的表達(dá)。結(jié)果BNP后處理在4 h再灌注后可以顯著減少心肌損傷大小和LDH，CK的表達(dá)（P<0.05），明顯減少TNFα，IL6的增長(zhǎng)。同時(shí)，在心肌損傷中可以明顯抑制HMGB1的表達(dá)。結(jié)論BNP后處理可以通過抑制HMGB1的表達(dá)來保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。

關(guān)鍵詞：心肌缺血再灌注;腦利鈉肽;后處理;高遷移率族蛋白1

中圖分類號(hào)：R542.2R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.16721349.2015.01.020文章編號(hào)：16721349（2015）01005503

Effect of Btype Natriuretic Peptide Postconditioning on Myocardial Ischemiareperfusion

Huang Xingyue，Hu Gangying，Huang Tingting，Xie Qing，Li Dan，Hu Xiaorong，Jiang Hong

The Peoples Hospital，Wuhan University，Wuhan 430060，Hubei，China

Corresponding Author：Hu Xiaorong

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of Btype natriuretic peptide （BNP） preconditioning on myocardial ischemiareperfusion （I/R） injury and the expression of high mobility group box 1 protein （HMGB1） in rats.MethodsAnesthetized male rats were ischemia for 30 min，and then were treated with BNP in 15 min before reperfusion until the end of reperfusion，and followed by reperfusion for 4 hours. Lactate dehydrogenase （LDH），creatine kinase （CK），tumor necrosis factorα （TNFα），interleukin6（IL6） and infarct size were measured. HMGB1 expression was assessed by immunoblotting. ResultsThe Results showed that treatment of BNP postconditioning could significantly decrease the infarct size and the levels of LDH and CK after 4 h reperfusion （all P<0.05）. BNP postconditioning could also significantly inhibit the increases of TNFα and IL6 （both P<0.05）. Meanwhile，BNP postconditioning could significantly inhibit HMGB1 expression induced by I/R. ConclusionThe present study suggested that postconditioning of BNP could protect against myocardial I/R injury which might be associated with inhibiting HMGB1 expression.

Key words：myocardial ischemia;Btype natriuretic peptide;postconditioning;reperfusion;high mobility group box 1 protein

高遷移率族蛋白1（high mobility group box1 protein，HMGB1）是一種無染色體核的蛋白質(zhì)，通常被壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞或者被激活的非特異性免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞）抵抗性的大量釋放[1，2]。 在一些心血管疾病中，HMGB1已經(jīng)被證實(shí)是一種新型的促炎性細(xì)胞因子[36]。最近的研究顯示HMGB1作為一種早期促炎性細(xì)胞因子在心肌缺血再灌注過程中持續(xù)存在，與傳統(tǒng)的早期促炎性細(xì)胞因子例如腫瘤壞死因子α（TNFα）和白介素6（IL6）一樣，而且還能夠促進(jìn)TNFα和IL6的釋放。然而，HMGB1 A box 縮氨酸（一種特殊的HMGB1拮抗物）可以減少心肌缺血再灌注損傷并抑制TNFα和IL6的釋放[3]。炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素[7，8]。

B型鈉尿肽（BNP）的預(yù)處理和后處理能夠減少心HMGB1在心肌缺血再灌注損傷中有著重要的影響。

肌缺血再灌注損傷，包括減少心肌酶的增加、梗死面積和細(xì)胞凋亡[912]。本研究通過大鼠心肌缺血再灌注模型，來驗(yàn)證BNP后處理是否可以通過抑制炎癥反應(yīng)（包括HMGB1的表達(dá)）來減少心肌缺血再灌注損傷的假設(shè)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)SPF級(jí)雄性SD大鼠（250 g～300 g），隨機(jī)分成3組。假手術(shù)組（SO）10只：只開胸，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈;缺血再灌組（I/R）15只：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）30 min，再灌注4 h;腦利鈉肽后處理組（BNP ?I/R）15只：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）30 in，再灌注4 。在再灌注前15 min給大鼠輸入溶解于無菌鹽水中的BNP 0.03 μg/（kg·min）[11]靜脈恒速維持至再灌注結(jié)束。

用3%戊巴比妥鈉（45 g/kg）腹腔麻醉大鼠，后背位固定，氣管插管連接動(dòng)物呼吸機(jī)，頻率70次/min，潮氣量（3～4）mL/100 g，連接心電圖機(jī)，持續(xù)記錄心電圖變化。緊靠胸骨正中于左側(cè)第23肋間打開胸腔，暴露心臟，剪開心包膜，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間，用穿有50縫合線的3/8彎針鉤繞LAD，下墊一帶凹槽的細(xì)小塑料管，待心電圖恢復(fù)穩(wěn)定后連同細(xì)管一起結(jié)扎，以結(jié)扎后心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯上抬及心臟表面相應(yīng)區(qū)域發(fā)紺和蒼白表明缺血成功;30 min后沿凹槽剪斷結(jié)扎線，以ST段下降1/2以上、心臟表面缺血區(qū)發(fā)紺和蒼白恢復(fù)表明心肌組織成功恢復(fù)再灌注。

1.2梗死面積評(píng)估再灌注4 h后，經(jīng)股靜脈注入1%依文思藍(lán)2 mL，冰PBS液沖洗之后，立即置于-20℃冰箱中冷凍15 min，垂直心臟左心室長(zhǎng)軸將每個(gè)心臟切成厚（1～2） mm 5個(gè)薄片，置入1%2，3，5氯化三苯基四氮唑溶液（TTC溶液，濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液PBS，pH7.4）中，37 ℃避光恒溫孵育15 min。非缺血區(qū)為藍(lán)色。缺血區(qū)內(nèi)的非梗死區(qū)心肌組織含有的脫氫酶將無色氧化型染料TTC還原成磚紅色，而梗死區(qū)心肌細(xì)胞由于細(xì)胞膜損傷，脫氫酶漏出，不能將TTC還原，因此為灰白色。孵育結(jié)束后，取出心肌組織置于10%甲醛中固定12 h，分離缺血區(qū)和梗死區(qū)，用天平精確稱重，計(jì)算梗死區(qū)重量與缺血區(qū)重量的比值，即梗死面積百分比。

1.3心肌損傷評(píng)估再灌注4 h結(jié)束后，經(jīng)頸動(dòng)脈取血2 mL，以3 000 r/min離心15 min，提取上清，按試劑盒說明采用紫外分光光度法測(cè)定CK和LDH的活性（中國(guó)南京建成生物工程研究所）。

1.4TNFα和IL6的測(cè)量在心肌組織上層的TNFα和IL6，按試劑盒說明應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測(cè)量（中國(guó)南京建成生物工程研究所）。

1.5HMGB1蛋白表達(dá)檢測(cè)左心室的局部缺血樣本被冷凍后應(yīng)用Western blot分析HMGB1的蛋白表達(dá)量，HMGB1單克隆抗體檢測(cè)HMGB1蛋白含量[13]。（Santa Cruz，USA），用光密度儀掃描分析，以內(nèi)參GAPDH蛋白條帶光密度值作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算HMGB1蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.6心肌組織MDA和SOD的檢測(cè)再灌注4 h結(jié)束后，取缺血部分心肌組織按試劑盒說明測(cè)定MDA和SOD的活性，分光計(jì)分別測(cè)定532 nm 和550 nm時(shí)的吸收率。心肌組織勻漿樣本中所有蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯藍(lán)方法測(cè)定（南京建成生物工程研究所）。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表達(dá)。梗死面積比較采用t檢驗(yàn);多組比較采用單因素ANVOA或KruskaleWallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用StudentNewmanKeuls檢驗(yàn)或MannWhitney U檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1梗死面積在4 h再灌注后，與I/R組（52.8±4.4）%相比，BNP后處理組能夠明顯減少心肌梗死面積（28.9±3.7）%（P<0.05）。

2.2LDH和CK值在4 h再灌注后，I/R組血清中LDH和CK水平明顯較SO組0.182增加（P<0.05）。而BNP后處理顯著抑制缺血再灌注引起的LDH和CK水平增加（P<0.05）。詳見表1。

2.3TNFα和IL6值4 h再灌注后，相比SO組，所有再灌注組的TNFα和IL6水平明顯增加（P<0.05）。BNP處理過的組中TNFα 和IL6的增加被明顯抑制（P<0.05）。詳見表2。

2.4HMGB1表達(dá)再灌注4 h后，I/R組心肌組織HMGB1表達(dá)明顯較SO組增加（P<0.05）。而BNP后處理組為0.287，顯著抑制了缺血再灌注引起的心肌組織HMGB1表達(dá)的增加（P<0.05）。

2.5MDA和SOD的表達(dá)在4 h的再灌注后，與SO組相比，I/R組心肌組織MDA表達(dá)明顯增加，而SOD表達(dá)明顯減少（P<0.05）。BNP后處理顯著地抑制了缺血再灌注引起的MDA表達(dá)增加和SOD表達(dá)減少（P<0.05）。詳見表3。

3討論

所有的預(yù)處理和后處理在心肌缺血再灌注損傷中都有著保護(hù)作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，BNP后處理可以減少心肌梗死面積和心肌激酶，這也符合以往的研究結(jié)果[9，10]。BNP后處理可以減少TNFα，IL6和HMGB1的表達(dá)。而HMGB1在心肌缺血再灌注時(shí)表達(dá)增多，且促進(jìn)TNFα和IL6的表達(dá)，用HMGB1處理過的大鼠心肌缺血再灌注損傷將更嚴(yán)重，而抑制HMGB1的表達(dá)可以減少這種損傷并減少TNFα和 IL6的表達(dá)[3]。Hu等[13]證實(shí)HMGB1可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的影響至關(guān)重要。Wu等[10]報(bào)道BNP后處理可以減少心肌細(xì)胞凋亡。

活性氧可能與HMGB1的釋放有關(guān)，BNP處理能夠抑制氧化應(yīng)激[14，15]。Tang等[16]證明活性氧之一的過氧化氫可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放HMGB1。Tsung 等[17]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)肝細(xì)胞釋放HMGB1依舊是由活性氧控制的。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)抗氧化物可抑制HMGB1表達(dá)并減少急性重癥胰腺炎大鼠的胰腺損傷[19，20]。因此，抑制活性氧的產(chǎn)生可能抑制HMGB1的表達(dá)。Sun等[12]證實(shí)BNP可通過抑制活性氧的釋放來減少心肌缺血再灌注的損傷。BNP后處理可以通過抑制心肌缺血再灌注引起的活性氧來減少損傷，而活性氧正與HMGB1的表達(dá)有某種關(guān)系。本研究表明BNP后處理可以通過抑制HMGB1的表達(dá)來減少心肌缺血再灌注損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1]Scaffidi P，Misteli T，Bianchi ME.Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J].Nature，2002，418：191195.

[2]Bell CW，Jiang W，Reich CF，et al.The extracellular release of HMGB1 during apoptotic cell death[J].Am J Physiol Cell Physiol，2006，291：C13181325.

[3]Andrassy M，Volz HC，Igwe JC，et al.Highmobility group box1 in ischemiareperfusion injury of the heart[J].Circulation，2008，117：32163226.

[4]Hu X，Jiang H，Bai Q，et al.Increased serum HMGB1 is related to the severity of coronary artery stenosis[J].Clin Chim Acta，2009，406：139142.

[5]Andrassy M，Volz HC，Riedle N，et al.HMGB1 as a predictor of infarct transmurality and functional recovery in patients with myocardial infarction[J].J Intern Med，2011，270：245253.

[6]Hu X，Zhou W，Bai Q，et al.Increased serum high mobility group box 1 protein in patients with atrial fibrillation[J].Biomed Aging Pathol，2011，1：5255.

[7]Frangoginis NG，Smith CW，Entman ML.The inflammatory response in myocardial infarction[J].Cardiovasc Res，2002，53：3147.

[8]Hu X，F(xiàn)u W，Jiang H.HMGB1：A potential therapeutic target for myocardial ischemia and reperfusion injury[J].Int J Cardiol，2012，155：489489.

[9]Burley DS，Baxter GF.Btype natriuretic peptide at early reperfusion limits infarct size in the rat isolated heart[J].Basic Res Cardiol，2007，102：529541.

[10]Wu B，Jiang H，Lin R，et al.Pretreatment with Btype natriuretic peptide protects the heart from ischemiareperfusion injury by inhibiting myocardial apoptosis[J].Tohoku J Exp Med，2009，219：107114.

[11]Ren B，Wu H，Yin R，et al.B type natriuretic peptide pretreatment attenuates heart ischemiareperfusion injury in rats[J].Transplant Proc，2010，42：44964498.

[12]Sun Y，Deng T，Lu N，et al.Btype natriuretic peptide protect cardiomyocytes at reperfusion via mitochondrial calcium uniporter[J].Biomed Pharmacother，2010，64（3）：170176：2010，64：170176.

[13]Hu X，Zhou X，He B，et al.Minocycline protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high mobility group box 1 protein in rats[J].Eur J Pharmacol，2010，638：8489.

[14]Hausenloy DJ，Yellon DM.Survival kinases in ischemic preconditioning and postconditioning[J].Cardiovasc Res，2006，70：240253.

[15]Gottlieb RA，Engler RL.Apoptosis in myocardial ischemiareperfusion[J].Ann N Y Acad Sci，1999，68：412426.

[16]Tang D，Shi Y，Kang R，et al.Hydrogen peroxide stimulates macrophages and monocytes to actively release HMGB1[J].J Leukoc Biol，2007，81：741747.

[17]Tsung A，Klune JR，Zhang X，et al.HMGB1 release induced by liver ischemia involves tolllike receptor 4 depedent reactive oxygen species production and calciummediated signaling[J].J Exp Med，2007，204：29132923.

[18]Zhang ZW，Zhang QY，Zhou MT，et al.Antioxidant inhibits HMGB1 expression and reduces pancreas injury in rats with severe acute pancreatitis[J].Dig Dis Sci，2010，55：25292536.

[19]Yasuda T，Ueda T，Takeyama Y，et al.Significant increase of serum highmobility group box chromosomal protein 1 levels in patients with severe acute pancreatitis[J].Pancreas，2006，33：359363.

[20]Sawa H，Ueda T，Takeyama Y，et al.Blockade of high mobility group box1 protein attenuates experimental severe acute pancreatitis[J].World J Gastroenterol，2006，12：76667670.

（收稿日期：20140312）

（本文編輯王雅潔）