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    比較四種工藝提取的莪術(shù)油對(duì)Hela細(xì)胞外LDH活性影響

    2015-10-21 19:51張衛(wèi)霞羅俊潘年松
    關(guān)鍵詞:活性比較

    張衛(wèi)霞 羅俊 潘年松

    【摘要】目的 探討四種工藝從莪術(shù)中提取的揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞外LDH活性影響的差異性,并以此旁證遴選最優(yōu)工藝。方法 分別采用石油醚浸提法、超臨界CO2萃取法、壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制、水蒸氣蒸餾法提取莪術(shù)油,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)等純度鑒定后,分別配制成濃度為10、20、40、80、160、320、640μg/ml的莪術(shù)油干預(yù)Hela細(xì)胞72h,按照LDH試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞外LDH水平。結(jié)果 壓榨法提取的莪術(shù)油在20·g/ml、其它三種方式提取莪術(shù)油20·g/ml作用于Hela細(xì)胞72h后的LDH值與陰性組比較呈現(xiàn)出顯著差異性,且明顯呈量效正相關(guān)。結(jié)論 四種工藝提取的莪術(shù)油均可量效正相關(guān)地激活LDH;壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制莪術(shù)油對(duì)LDH的激活作用顯示出量效敏感優(yōu)勢(shì),提示壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制可能為最佳工藝。

    【關(guān)鍵詞】:莪術(shù)油;LDH;活性;比較

    【中圖分類號(hào)】R722.12 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949(2015)03-0144-02

    基金項(xiàng)目:貴州省社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(黔科合SY(2008)3027號(hào))。

    溫莪術(shù)為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖,具行氣破血,消積止痛之功。用于治療瘢瘕痞塊,淤血經(jīng)閉,食積脹痛,早期宮頸癌1。目前關(guān)于溫莪術(shù)中揮發(fā)油的提取工藝有水蒸氣蒸餾提取法、CO2超臨界萃取提取法、鮮品榨汁提取法、石油醚回流提取法2-4,但較少有文獻(xiàn)就揮發(fā)油的各種提取工藝的藥效學(xué)進(jìn)行比較,鑒于中藥的不同制備工藝所得的藥品抗腫瘤藥效也存在不同2。因此,對(duì)在不同工藝中提取的同一藥品進(jìn)行藥效比較從而篩選出最佳提取工藝是有必要的。

    1.材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 溫莪術(shù)藥材購(gòu)于四川雙流縣溫郁金基地,經(jīng)遵義醫(yī)藥高等??茖W(xué)校中藥學(xué)副教授張學(xué)愈鑒定為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖。四種莪術(shù)油(分別由水蒸氣蒸餾提取法、超臨界CO2萃取提取法、鮮品榨汁經(jīng)水蒸氣蒸餾精制法、石油醚浸提法提取,由遵義醫(yī)藥高等??茖W(xué)校制備,用Tween-80溶解,配成10mg/mL的貯存溶液,4℃避光保存。

    1.2試劑 人宮頸癌Hela細(xì)胞株(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,細(xì)胞編號(hào):GDC009);RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT及胰酶(Sigma公司);胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)。

    1.3儀器 BIO-TEK ELX 800-UV全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特),LC-2900型高效液相色譜儀(上海天普)。

    1.4 方法

    1.4.1細(xì)胞的培養(yǎng) 取人宮頸癌Hela細(xì)胞,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中,每1-2天傳代一次。

    1.4.2 MTT試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞消化并制備成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/ml,按每孔180·l接種于96孔板,培養(yǎng)24h后分為空白調(diào)零組(僅加培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照組(無血清培養(yǎng)基)、陽(yáng)性對(duì)照組(5-Fu 10·g/ml)、溶酶組(加入等體積的0.5% Tween-80溶液)揮發(fā)油組(四種方式提取揮發(fā)油,均設(shè)10、20、40、80、160、320、640·g/ml七個(gè)濃度梯度組),每組設(shè)10個(gè)平行孔,每孔加入20ul的藥物,繼續(xù)培養(yǎng)72h,于結(jié)束前4h小心吸去上清,加入無血清培養(yǎng)基200μl/孔,并加入20μl/孔濃度為5mg/ml的MTT,培養(yǎng)4h后吸棄培養(yǎng)基,每孔加入DMSO 150μl,混合器振蕩10min,使其充分溶解,置于自動(dòng)酶標(biāo)儀上,以490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度OD值[4]。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

    1.4.3 LDH活性檢測(cè) 收集上述加無血清培養(yǎng)基之前的上清液,根據(jù)南京建成LDH試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞外LDH水平。LDH活性(U/L)=(測(cè)定孔OD值-對(duì)照孔OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)孔OD值-空白孔OD值)×標(biāo)準(zhǔn)濃度(0.2mmol/L)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)×1000。

    1.4.5 統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)以X±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為有差異,P<0.01認(rèn)為有顯著性差異。

    2.結(jié)果與討論

    四種工藝提取莪術(shù)揮發(fā)油的LDH值較陰性對(duì)照組明顯升高(P<0.05,P<0.01),其中鮮品榨汁經(jīng)水蒸氣蒸餾精制法揮發(fā)油在320ug/ml時(shí)LDH值最高(表1)。

    表1 四種方式提取莪術(shù)油作用于Hela細(xì)胞72h后的LDH值(U/L) (X±s,n=10)

    藥物濃度(·g/ml) 莪(石) 莪(超) 莪(壓) 莪(水) 陰性對(duì)照組0 — — — — 97.39±12.3610 145.46±9.84 101.65±8.43 187.86±11.78﹡ 125.13±12.83 20 164.66±7.51﹡ 136.85±13.36﹡ 243.13±12.36△ 150.67±15.82﹡ 40 234.12±21.32△ 162.32±18.44﹡ 296.65±19.14△ 257.25±30.77△ 80 298.15±22.77△ 207.82±15.99△ 338.39±23.89△ 277.72±23.01△ 160 398.31±17.28△ 280.58±41.92△ 437.47±25.71△ 315.97±50.00△ 320 428.13±25.09△ 319.83±18.85△ 463.10±16.76△ 370.31±22.73△ 640 395.92±40.38△ 331.71±40.38△ 422.35±27.25△ 386.51±36.54△ 與陰性對(duì)照組比較﹡P<0.05,△P<0.01

    從實(shí)驗(yàn)結(jié)果總體趨勢(shì)而言,壓榨法提取的莪術(shù)油在20·g/ml、其它三種方式提取莪術(shù)油20·g/ml作用于Hela細(xì)胞72h后的LDH值與陰性組比較呈現(xiàn)出顯著差異性,且明顯呈量效正相關(guān)。

    僅從壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制莪術(shù)油對(duì)激活LDH 活性較優(yōu)而論,從莪術(shù)中提取揮發(fā)油以先壓榨獲得粗油再水蒸氣蒸餾濃縮提取精油工藝為佳。

    參考文獻(xiàn)

    [1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典,一部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005

    [2]鄒俊,涂銘旌,張學(xué)愈,等.不同提取工藝制備的溫莪術(shù)揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,39(4):671~672.

    [3]張學(xué)愈,盛勇,鄒俊,涂銘旌,潘年松,等.石油醚提取過50目和過325目篩目篩溫莪術(shù)揮發(fā)油收率比較[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(2):292~293.

    [4]肖艷,李俊東,等.MTT法體外藥敏實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)宮頸癌細(xì)胞藥物敏感性的初步探討[J].癌癥,2007,26(4):386-389.

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