血常規(guī)和血生化指標(biāo)在患強(qiáng)直性脊柱炎食蟹猴中的臨床價(jià)值

李玉瑩，麥冬梅，賈歡歡，吳志恒，何剛?cè)A，唐爽捷，馬承紅，盧 麗*

(1.廣東藥科大學(xué)，廣州 511400； 2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，廣州 510663； 3.廣州春盛生物研究院有限公司，廣州 510900； 4.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510000)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種病因未明的自身免疫性疾病，主要累及骶髂及脊柱關(guān)節(jié)[1]，青少年多發(fā)，男性多于女性，隨著病情的進(jìn)展，AS患者的生活質(zhì)量會(huì)受到極大的影響，目前尚無(wú)良好的治療藥物和干預(yù)措施。

疾病動(dòng)物模型的構(gòu)建是研究疾病發(fā)生機(jī)理和防治策略的基礎(chǔ)[2]，隨著對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎病因病機(jī)的研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已構(gòu)建了若干個(gè)強(qiáng)直性脊柱炎動(dòng)物模型[3]，遺憾的是這些模型均為嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型，與AS患者臨床表現(xiàn)存在較大差異。非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物在遺傳背景、生理結(jié)構(gòu)等方面與人類(lèi)高度相似[4-5]，課題組經(jīng)過(guò)多年研究，建立了一種自發(fā)性AS食蟹猴動(dòng)物模型，將為AS相關(guān)藥物的安全性和有效性評(píng)價(jià)起到重要作用。動(dòng)物外周血血常規(guī)、血生化指標(biāo)的檢查，是藥物安全性和有效性評(píng)價(jià)最常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)，本研究將對(duì)AS食蟹猴血常規(guī)和血生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)，以期尋找到適合AS食蟹猴評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，為AS的后續(xù)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從約2000只食蟹猴群體中，篩選自發(fā)性AS食蟹猴 40 只，雌性 27 只，雄性 13 只，年齡：(10.22±3.00)歲，體重:(4.46±1.93)kg；篩選雌性 25 只，雄性 15 只，年齡：(11.00±3.19)歲，體重:(5.52±1.60)kg。已適應(yīng)喂養(yǎng)2年。兩組動(dòng)物年齡性別等基本生理參數(shù)均衡可比。級(jí)別：普通級(jí)；動(dòng)物由廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司提供[SCXK(粵)2019-0027]。已經(jīng)通過(guò)廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所IACUC的審查(IACUC2018002)，符合“3R”原則。飼養(yǎng)條件：群居飼養(yǎng)于廣東春盛生物研究院有限公司[SYXK(粵)2015-0152]，環(huán)境溫度18℃～26℃，相對(duì)濕度 40%～70%，自然采光。

1.2 主要試劑與儀器

血常規(guī)：血紅細(xì)胞分析用稀釋液(CELLPACK DFL)、Hb溶血?jiǎng)?(SULFOLYSER)、WNR 溶 血?jiǎng)?(Lysercell WNR)、WDF 溶血?jiǎng)?Lysercell WDF)、WDF 染色液(Fluorocell WDF)、WNR染色液(Fluorocell WNR)、PLT 熒光染色液(Fluorocell PLT) (批號(hào)分別為:A7010、A7014、A8006、A7019、A7062、A7047、A7094，日本 Sysmex 株式會(huì)社)；血液分析儀XN-1000 V[B1]型(日本 Sysmex 株式會(huì)社)。

血生化：白蛋白試劑盒、總蛋白試劑盒、堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒、總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒。試劑均為上?？迫A生物工程股份有限公司產(chǎn)品；儀器使用3100型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AS動(dòng)物選擇

通過(guò)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行體格檢查，并使用測(cè)角儀來(lái)評(píng)估脊柱的曲率和膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)范圍(ROM)進(jìn)行自發(fā)性AS動(dòng)物的初篩[6]，隨后進(jìn)行X線檢查，判斷標(biāo)準(zhǔn)與人類(lèi)AS患者判斷標(biāo)準(zhǔn)相同：0 級(jí)：影像學(xué)檢查未見(jiàn)病變，骨質(zhì)結(jié)構(gòu)完全正常；Ⅰ級(jí)：骨關(guān)節(jié)疑似存在硬化、侵蝕現(xiàn)象；Ⅱ級(jí)：可見(jiàn)明顯硬化及侵蝕現(xiàn)象，并表現(xiàn)出輕度異常情況，但關(guān)節(jié)間隙不十分明顯改變；Ⅲ級(jí)：出現(xiàn)明顯骨質(zhì)硬化及侵襲現(xiàn)象，可見(jiàn)骨質(zhì)重度異常，關(guān)節(jié)腔隙可見(jiàn)明顯改變，見(jiàn)部分強(qiáng)直變化；Ⅳ級(jí)：大部分脊柱出現(xiàn)強(qiáng)直變化或完全強(qiáng)直，表現(xiàn)出嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)異常[7]。再配合細(xì)胞因子檢查：C-反應(yīng)蛋白(C-reactionprotein，CRP)、含有瓜氨酸抗體的抗環(huán)肽(抗CCP抗體)、抗鏈球菌溶血素O(anti-Streptolysin，ASO)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)和類(lèi)風(fēng)濕因子(IgG-RF& IgM-RF)。并排除其他疾病，如(1)自身免疫性疾病(類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)；(2)合并感染性疾病或貧血；(3)患有血液學(xué)疾病；(4)肝、腎功能損害；(5)患有心腦血管疾?。?6)患有惡性腫瘤。

1.3.2 樣本采集

(1)血常規(guī)樣本采集

動(dòng)物禁食過(guò)夜后，非麻醉狀態(tài)下使用 2 mL 含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)真空采血管對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用前肢頭靜脈采血 2 mL，保存樣本并于1.5 h內(nèi)送檢。

(2)血生化樣本采集

1976年，美國(guó)學(xué)者Cremin在《公共教育》一書(shū)中正式提出了教育生態(tài)學(xué)的概念，正式把焦點(diǎn)集中在教育與周?chē)h(huán)境因素的相互作用關(guān)系，為教育學(xué)的發(fā)展思路提供了新的視角。1987年，美國(guó)學(xué)者Goodlad提出了“文化生態(tài)系統(tǒng)(cultural ecosystems)”的概念，指出學(xué)校應(yīng)從管理入手統(tǒng)籌各種生態(tài)因子提高辦學(xué)效果。

動(dòng)物禁食過(guò)夜后，非麻醉狀態(tài)下使用 3 mL 促凝真空管對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用前肢靜脈采血3 mL，樣本于1.5 h 內(nèi)送檢。血液樣本室溫下靜置3 h后，3000 r/min，離心10 min，取血清。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

(1)血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

使用 Sysmex XN-1000 V 全自動(dòng)血液分析儀對(duì)動(dòng)物抗凝血進(jìn)行以下指標(biāo)測(cè)定:白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、淋巴細(xì)胞(LYMPH)、單核細(xì)胞(MONO)、嗜酸性粒細(xì)胞(EO)、嗜堿性粒細(xì)胞(BASO)。計(jì)算中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(NLR)、單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(MLR)、嗜酸性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(ELR)、嗜堿性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(BLR)。

(2)血生化指標(biāo)測(cè)定

使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)相關(guān)的生化指標(biāo)，包括：堿性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、球蛋白(GLOB)、總膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、白蛋白與球蛋白比值(A/G)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AS組食蟹猴與對(duì)照組食蟹猴的檢測(cè)指標(biāo)的比較

與對(duì)照組相比，AS組WBC、NEUT、MONO、EO、BOSO、MPV、NLR、MLR、ELR和BLR均顯著升高，LYMPH顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PLT無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AS組與對(duì)照組的血常規(guī)指標(biāo)的對(duì)比Table 1 Comparison of complete blood count indexes between AS group and control group

2.1.2 血生化指標(biāo)的比較

與對(duì)照組相比，AS組TP、GLOB、ALP、CHO顯著升高；ALB、A/G、HDL-C、LDL-C顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TG無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 ROC曲線評(píng)價(jià)研究指標(biāo)對(duì)AS食蟹猴的診斷價(jià)值

2.2.1 血常規(guī)指標(biāo)對(duì)AS食蟹猴的診斷價(jià)值

使用ROC來(lái)評(píng)價(jià)MPV、WBC、BASO、EO、MONO、LYMPH、NEUT、NLR、MLR、ELR和BLR對(duì)AS食蟹猴的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示它們的AUC值分別是：0.736(0.626～0.846)、0.788(0.688～0.889)、0.683(0.566～0.801)、0.815(0.716～0.914)、0.681(0.564～0.797)、0.215(0.118～0.313)、0.85(0.768～0.933)、0.894(0.826～0.961)、0.896(0.828～0.963)、0.87(0.789～0.951)、0.897(0.832～0.963)。其中各白細(xì)胞比值(NLR、MLR、BLR、ELR)的AUC值均高于其他指標(biāo)，BLR的AUC值最高，靈敏度和特異度分別為0.75和0.92。(圖1、表3)

表2 AS組與對(duì)照組的血生化指標(biāo)的對(duì)比Table 2 Comparison of blood biochemical indexes between AS group and control group

2.2.2 血生化指標(biāo)對(duì)AS食蟹猴的診斷價(jià)值

使用ROC來(lái)評(píng)價(jià)TP、ALB、GLOB、A/G、CHO、HDL-C、LDL-C和ALP對(duì)AS食蟹猴的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示它們的AUC值分別是：0.678(0.562～0.795)、0.048(0.007～0.09)、0.942(0.889～0.995)、0.047(0.002～0.091)、0.719(0.606～0.831)、0.295(0.182～0.408)、0.333(0.211～0.455)、0.934(0.880～0.987)。其中GLOB和ALP的AUC值均高于其他指標(biāo)，GLOB的AUC值最高，靈敏度和特異度分別為0.878和0.975。(表4、圖2)

圖1 ROC曲線評(píng)價(jià)研究血常規(guī)指標(biāo)對(duì)AS 食蟹猴的診斷價(jià)值Figure 1 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

表3 ROC曲線評(píng)價(jià)血常規(guī)指標(biāo)對(duì)AS食蟹猴的診斷價(jià)值Table 3 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

表4 ROC曲線評(píng)價(jià)血生化指標(biāo)對(duì)AS食蟹猴的診斷價(jià)值Table 4 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

圖2 ROC曲線評(píng)價(jià)研究血生化指標(biāo)對(duì)AS 食蟹猴的診斷價(jià)值Figure 2 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the blood biochemical index for AS cynomolgus monkeys

3 討論

強(qiáng)直性脊柱炎是以中軸和骶髂附著點(diǎn)炎癥為主要癥狀的全身免疫性疾病，發(fā)病早、致殘率高、病程長(zhǎng)，目前尚無(wú)良好的治療手段[10]。目前，AS的病情評(píng)估和診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及ESR、CRP等指標(biāo)檢查，但是影像學(xué)檢查價(jià)格昂貴且不便，不適合AS食蟹猴較多數(shù)量的初篩。本研究通過(guò)對(duì)血常規(guī)、白細(xì)胞比值(NLR、MLR、ELR、BLR)和血生化部分指標(biāo)的分析來(lái)探究各指標(biāo)對(duì)AS食蟹猴的診斷價(jià)值。

NLR和MLR作為炎癥標(biāo)志物在很多疾病中被關(guān)注，NLR和MLR異常增加與一些疾病炎癥活動(dòng)或預(yù)后有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等[11-12]。本研究結(jié)果顯示與正常對(duì)照組的食蟹猴相比，AS食蟹猴的NLR和MLR均顯著升高。也有文獻(xiàn)結(jié)果顯示在AS中NLR與ESR和CRP呈正相關(guān)[13]，MLR與CRP呈正相關(guān)[14-15]。嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞都是一種免疫效應(yīng)細(xì)胞，通常占血液白細(xì)胞的5%和1%以下。本研究結(jié)果表明在AS食蟹猴中EO和BASO均顯著增高，這可能與AS是一種慢性炎癥為主的自身免疫性疾病有關(guān)。周振興等[16]研究表明由于大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的異常分泌導(dǎo)致患者嗜酸性粒細(xì)胞顯著增高；嗜堿性粒細(xì)胞除了在過(guò)敏反應(yīng)和寄生蟲(chóng)感染中的活性外，Chirumbolo等[17]研究證明在固有免疫和免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用發(fā)生炎癥時(shí)血液中的血細(xì)胞比例發(fā)生變化。目前關(guān)于ELR和BLR的研究較少，但是在本研究結(jié)果中AS食蟹猴的ELR和BLR升高，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Yang等[13]的研究中關(guān)于AS病人的結(jié)果基本一致。MPV是血小板活化的標(biāo)志物，Kisacik等[18]研究發(fā)現(xiàn)MPV可能是診斷AS靈敏度更高的指標(biāo)，并且發(fā)現(xiàn)MPV在AS的活動(dòng)期呈較低水平，在非活動(dòng)期MPV水平較高。在我們的研究結(jié)果中AS組的食蟹猴較正常對(duì)照組的食蟹猴的MPV顯著升高，而PLT無(wú)顯著性差異，與Kisacik等[18]的研究結(jié)果中的AS病人非活動(dòng)期指標(biāo)變化相符。本研究探討血常規(guī)和血生化指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)自發(fā)性AS食蟹猴的診斷價(jià)值。ROC曲線結(jié)果顯示，在血常規(guī)指標(biāo)中，白細(xì)胞比值的各指標(biāo)(NLR、MLR、ELR、BLR)的靈敏性和特異性都均高于各類(lèi)白細(xì)胞指標(biāo)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。

ALP 主要由肝和成骨細(xì)胞合成，是反映成骨活動(dòng)的重要標(biāo)志物，本研究結(jié)果顯示AS食蟹猴ALP顯著升高，這可能是隨著疾病進(jìn)程會(huì)出現(xiàn)脊柱及關(guān)節(jié)骨化導(dǎo)致。GLOB 是一個(gè)計(jì)算值,是血清中的“非白蛋白”蛋白的總量,免疫反應(yīng)增強(qiáng)是AS重要的臨床表現(xiàn),GLOB的升高可能是由于AS的炎癥特征導(dǎo)致機(jī)體免疫蛋白升高。張曉剛等[19]的研究結(jié)果表現(xiàn)為人類(lèi)AS患者的TG和CHO顯著升高，LDL-C和HDL-C 下降，與本研究結(jié)果中AS食蟹猴的指標(biāo)大致相同。ALB是主要用于反映機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和慢性消耗性疾病的指標(biāo)之一[20-21]，AS食蟹猴由于疼痛和全身炎癥會(huì)導(dǎo)致機(jī)體營(yíng)養(yǎng)吸收和物質(zhì)代謝能力降低，從而表現(xiàn)出ALB和A/G低于正常食蟹猴。在血生化指標(biāo)中，GLOB和ALP的AUC值均大于0.9，證明它們對(duì)于AS食蟹猴的診斷靈敏度和特異度較好。

綜合上述討論，本研究發(fā)現(xiàn)血常規(guī)、血生化檢查可作為一種快速、簡(jiǎn)便、可靠的手段，對(duì)自發(fā)AS食蟹猴模型進(jìn)行篩查、診斷和相關(guān)藥物的評(píng)價(jià)提供輔助診斷的手段。綜合ROC曲線結(jié)果，指標(biāo)NLR、MLR、ELR、BLR、ALP和GLOB是本研究指標(biāo)中靈敏度和特異度最佳的六個(gè)指標(biāo)，并且它們的變化可能與AS疾病活動(dòng)度有關(guān)，對(duì)AS有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是，本研究樣本量相對(duì)較小，還需后續(xù)進(jìn)行縱向研究，包括較大量的數(shù)據(jù)分析來(lái)進(jìn)一步探究這些指標(biāo)與疾病活動(dòng)度的相關(guān)情況。