柚皮中抑菌物提取工藝優(yōu)化研究

摘要[目的] 優(yōu)化柚皮提取類黃酮、類檸檬苦素的工藝條件。[方法]以柚皮為原料，采用“乙醇水浴法”提取類黃酮，采用“二氯甲烷回流法”提取類檸檬苦素。[結(jié)果] 提取類黃酮的最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25 g/ml、提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h，提取次數(shù)2次，類黃酮3次平均提取率為1.211%；提取類檸檬苦素的最佳工藝為料液比1∶15 g/ml，溫度55 ℃，提取2.5 h，提取次數(shù)2次，類檸檬苦素3次平均提取率為0.561%。[結(jié)論] 所得的多元二次回歸方程預(yù)測模型與實際情況擬合較好，可用于指導(dǎo)柚皮抑菌物的提取分離。

關(guān)鍵詞柚皮；類黃酮；類檸檬苦素；均勻設(shè)計；響應(yīng)面分析

中圖分類號S666.3；TS255.1文獻標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）05-259-04

Study on the Optimal Extraction Technology of Antimicrobial Substance from Pomelo Peels

TIAN Guang-wen，LI Peng-fei ，DU Li-hua et al （College of Life Sciences，Northwest A&F University，Yangling，Shaanxi 712100）

Abstract [Objective] The paper aims to set up an optimal method for extraction technology of flavonoids and limonoids from pomelo peels.[Method] Using “ethanol water bath method” extracts flavonoids； using “dichloromethane refluxing method” extracts limonoids.[Result] The optimal extraction conditions of flavonoids were ethanol concentration 60%，solid-liquid ratio 1∶25 g/ml，extracting temperature 70 ℃，extracting time 1.5 h and extraction 2 times.In these conditions，the average of three actual verification extraction yield of flavonoids was 1.211%.The optimum extraction condition of limonoids were solid-liquid ratio 1∶15 g/ml，extracting temperature 55 ℃，extracting time 2.5 h and extraction 2 times.In these conditions，the average of three actual verification extraction yield of limonoids was 0.561%.[Conclusion] The resulting multivariate quadratic regression equation prediction model fit well with the actual situation，can be used to guide the extraction and separation of antimicrobial substance from pomelo peels.

Key words Pomelo peel； Flavonoids； Limonoids； Uniform design method； Response surface methodology （RSM）

基金項目西北農(nóng)林科技大學(xué)校重點創(chuàng)新實驗項目（1210712162）。

作者簡介田廣文（1964- ），男，陜西藍田人，實驗師，從事生物學(xué)和食用菌實驗教學(xué)科研工作。

收稿日期2014-12-23

柚皮占整個柚子43%～48%[1]，在生鮮食用或加工時，大部分作為垃圾處理，不僅浪費資源而且污染了環(huán)境。從柚皮中提取安全高效的抗氧化、抑菌防腐活性物質(zhì)，符合“綠色環(huán)保健康”的概念。據(jù)近年研究，柚皮提取物中富含類黃酮、類檸檬苦素、胰島素類似物、酚酸、香精油等多種植物化學(xué)活性成分[1-2]。柚皮中的類黃酮化合物多與糖結(jié)合成苷，主要為柚皮苷、新陳皮苷、柚皮素蕓香苷等二氫黃酮類。柚皮中柚皮苷含量為1%～6%[2-6]，其具有抑菌、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等更多生理活性作用[7-10]。

類檸檬苦素在柑橘屬類中以柚類最高（56 mg/kg）、橙類次之（32 mg/kg）[10-14]。研究表明[12-14]，類檸檬苦素含量在果實中以種子最高，其次為果皮、果肉；在成熟果實中，中果皮（海綿層）含類檸檬苦素約1%。迄今分離到約300多種類檸檬苦素化合物，其代表物是檸檬苦素和諾米林，該類物質(zhì)具有殺蟲、抗瘧、抗病毒、抗腫瘤形成、抑菌、消炎等作用[1，3，11-15]。因此，柚皮已是天然防腐劑、抗病毒制劑、殺蟲劑等的良好來源[1-15]。

筆者在總結(jié)前人試驗的基礎(chǔ)上，通過科學(xué)試驗設(shè)計研究最大化提取柚皮中兩類抑菌物（類黃酮、類檸檬苦素），為進一步的抑菌試驗提供好原料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及試劑。

柚皮，當(dāng)?shù)爻袃?yōu)質(zhì)沙田柚自加工。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（Rutin 153-18-4，UV≥98%）、檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)樣品（Limonin 1180-71-8，HPLC≥98%）均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。主要試劑：乙醇、甲醇、石油醚（60～90 ℃）、乙醚、丙酮、濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、三氯化鐵、對二甲氨基苯甲醛、二氯甲烷等，國產(chǎn)分析純（AR）。

1.1.2主要儀器設(shè)備。

FW-400A高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州市長城科工貿(mào)有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇醫(yī)療器械廠；WFJ2000型可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1柚皮處理。

鮮柚果實→洗去雜物→剝皮→去果皮表面黃色油胞層→切成5 mm長寬條→50 ℃烘6～12 h至干（含水量不高于10%）→粉碎→過60目篩→裝入棕色廣口瓶→2～5 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2柚皮脫脂。

文獻報道[1-5，11，14，16]，脫脂效果的好壞對柚皮提取抑菌物有直接影響。該試驗按文獻最佳條件進行脫脂，即稱取100 g柚皮粉末各5份，放入5個棕色瓶，加4倍石油醚（60～90 ℃），pH 6.5，避光放置32 ℃下8 h。濾除石油醚，少許水沖洗，風(fēng)干裝瓶備用。

1.2.3類黃酮化合物提取。

1.2.3.1工藝流程。脫脂柚皮粉→乙醇水浴恒溫回流提取→抽濾→旋蒸濃縮→柚皮類黃酮。

1.2.3.2提取方法。

稱2.5 g脫脂柚皮粉于250 ml圓底燒瓶，加入乙醇混勻，恒溫回流提取1～3 h，然后抽濾，旋蒸濃縮至約為原體積1/3，移至25 ml容量瓶，加30%乙醇定容，適當(dāng)稀釋測吸光度。

1.2.3.3類黃酮化合物的測定（標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制）。采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[4，17-18]。

1.2.3.4樣品測定。

移取試驗樣液，加30%乙醇定容至25 ml，按“1.2.3.3”節(jié)方法顯色和測吸光度。據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算類黃酮質(zhì)量濃度，再計算柚皮總黃酮提取率。

類黃酮得率（%）=25×C×V1×100/（103×m×V2）

式中，C為類黃酮質(zhì)量濃度（mg/ml）；V1為移取試驗樣液的體積（ml）；V2為顯色所移取的試驗樣液體積（ml）；m為柚皮粉質(zhì)量（g）。

1.2.3.5類黃酮提取單因素試驗。據(jù)文獻[2-10，17-18]，分別考察提取溶劑、時間、溫度、料液比對類黃酮提取的影響（每樣稱柚皮粉2.5 g進行）。

1.2.3.6均勻試驗設(shè)計[19-20]。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以乙醇為提取溶劑，采用恒溫回流提取法，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）、提取溫度（X3）和提取時間（X4）為考察因素，以類黃酮得率為評價指標(biāo)，按均勻試驗設(shè)計方法安排試驗，優(yōu)選提取工藝。

1.2.4類檸檬苦素提取。

1.2.4.1 工藝流程。

脫脂柚皮粉→有機溶劑恒溫回流抽提→抽濾→減壓濃縮→類檸檬苦素物。

1.2.4.2提取方法。提取溶劑選擇：類檸檬苦素在不同有機溶劑中的溶解度不同[1，3，10-16，21-22]，在相同浸提條件下，該試驗分別選用無水乙醇、二氯甲烷、丙酮和乙醚為提取劑進行對比試驗。即按料液比1∶12 g/ml、50 ℃恒溫回流2 h后抽濾，50 ℃旋蒸濃縮，適當(dāng)稀釋濃縮液比色，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得率。

單因素試驗：據(jù)文獻[1，3，10-16，21-22]，影響恒溫回流法提取類檸檬苦素的因素主要是提取劑濃度、料液比、提取溫度和提取時間。該試驗改變其中某一因素進行試驗，以考察各因素對提取的影響。

類檸檬苦素提取工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計[23]：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以二氯甲烷為提取溶劑，根據(jù)Box-Behnken的組合試驗設(shè)計原理，選取料液比X1、提取溫度X2和提取時間X3 3個因素，自變量編碼見表1。以類檸檬苦素得率為考察指標(biāo)（Y），采用響應(yīng)面分析方法，確定最佳提取工藝條件。

1.2.4.3類檸檬苦素測定[16，21-22，24]。①

顯色劑Ehrlich試劑的配制。顯色劑A液：將125 mg對二-甲氨基苯甲醛溶于100 ml硫酸的乙醇溶液（65 ml濃硫酸∶35 ml無水乙醇，放冷使用）中。

顯色劑B液：準(zhǔn)確稱取三氯化鐵9.0 g，用蒸餾水溶解并定容至100 ml。使用時往A溶液中加入0.05 ml三氯化鐵水溶液，混合均勻，即得Ehrlich試劑。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品以無水乙醇配成370 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在6支試管中分別加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加無水乙醇至2.0 ml，再分別加入5.0 ml Ehrlich試劑，搖勻，靜置30 min，在300～700 nm范圍內(nèi)，最大吸收波長為550 nm，故選550 nm為測定波長，以空白液為參比。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（表2）。③樣品測定。

將所得提取物用無水乙醇溶解并定容至25 ml，取此溶液2 ml，分別加入5 ml顯色劑顯色30 min后于550 nm處測定吸光度。根據(jù)測得樣品吸光度A和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中類檸檬苦素濃度C，再換算為提取得率。

提取得率（%）=25C×10-3×100/m

式中，C為試樣中類檸檬苦素濃度（mg/ml）；m為柚皮粉質(zhì)量（g）。

2結(jié)果與分析

2.1類黃酮提取

2.1.1單因素試驗結(jié)果。試驗得到較佳的提取條件為：提取溶劑60%～70%乙醇，料液比1∶20～1∶30 g/ml，提取溫度70 ℃，提取時間2.0 h，提取次數(shù)2次（即提取完后殘渣再提取1次，合并提取液減壓濃縮）。

2.1.2均勻設(shè)計試驗結(jié)果。

表3每項類黃酮得率為2次提取平均值。以DPS軟件進行二次多項式逐步回歸，建立類黃酮得率（Y）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）、提取溫度（X3）、提取時間（X4）之間的回歸方程：Y=1.273 79-0.038 79X1-0.007 20X22+0.007 16X1X2+0.000 77X3X4，相關(guān)系數(shù)R=1.000 0，F(xiàn)值=7 861.702 6，P值=0.008 5<0.05，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=0.000 8，回歸方程顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。對各因子通徑分析，決定系數(shù)為0.999 97，說明實測值與模型有很好的一致性，回歸分析有效。

回歸方程各因素顯著性檢驗結(jié)果表明：方程中的X1（P=0.000 3）、X22（P=0.000 1）、X1X2（P=0.000 6）和X3X4（P=0.002 8）這4項對試驗結(jié)果均有顯著影響。從方程可知，X1、X22對提取影響較大，二者為負(fù)相關(guān)；而交互項X1X2、X3X4為正相關(guān)。

通過上述回歸方程對類黃酮得率進行預(yù)測，如表4所示，第2組的預(yù)測值（1.210 2%）最大，殘差較小，其對應(yīng)的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25 g/ml、提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h，提取2次。

2.2最優(yōu)提取條件的驗證

采用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶25 g/ml，提取溫度70 ℃，提取時間1.5 h，進行3次平行提取驗證，類黃酮的得率分別為1.205%、1.215%、1.213%，平均為1.211%，RSD為0.437%，結(jié)果重復(fù)性良好，與預(yù)測值接近，證明所得類黃酮的最優(yōu)提取工藝可行。

2.3檸檬苦素提取

2.3.1單因素試驗。

結(jié)果得出，乙醚的提取效果最差，丙酮提取率最高，其次是二氯甲烷和乙醇。但由于丙酮揮發(fā)性和毒性較大，綜合考慮組合試驗選二氯甲烷作為類檸檬苦素的提取溶劑（二氯甲烷也有一定毒性，使用中要注意皮膚、眼睛接觸與吸入）。

據(jù)報道[13，15，22，24]，類檸檬苦素是一類天然抗氧化物質(zhì)，過高的提取溫度會促使其氧化，降低提取效率，因此，提取溫度選在50～60 ℃進行。而從該試驗料液比、提取時間分別對提取率的影響結(jié)果知，料液比宜選1∶12 g/ml左右，提取時間宜選2 h。

于是，在溫度40、50、60 ℃，料液比為1∶12 g/ml，提取時間為2 h，進行二氯甲烷提取試驗，類檸檬苦素得率分別為0.279%、0.291%、0.288%。可見50 ℃以上得率較高。

2.3.2響應(yīng)面試驗及結(jié)果。以二氯甲烷為提取溶劑，按表1、表5進行試驗，每項類檸檬苦素得率為2次提取的平均值，試驗提取結(jié)果見表5。

利用Design Expert軟件對表5試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得回歸方程（模型）為Y=-3.893 7+30.211 1X1+0.120 1X2+0.107 8X3-0.039 6X1X2+0.451 0X1X3+0.002 5X2X3-204.524 0X21-0.001 1X22-0.060 3X23。各項系數(shù)絕對值代表因素對提取率影響程度，系數(shù)正負(fù)代表影響方向。

方差分析顯示：

F模型=220.35，P模型< 0.000 1**；FX1=100.68，PX1< 0.000 1**；FX2=519.91，PX2< 0.000 1**；FX3=45.81，PX3=0.000 3*；FX1X2=3.31，PX1X2=0.111 9；FX1X3=4.29，PX1X3=0.077 2；FX2X3=21.33，PX2X3=0.002 4*；FX21=580.01，PX21< 0.000 1**；FX22=456.49，PX22< 0.000 1**；FX23=129.19，PX23=< 0.000 1**；F失擬=3.62，P失擬=0.123 1（不顯著）。由此看出，一次項中X1、X2、X3的P值<0.01，說明3因素間均對響應(yīng)值有極顯著性影響，影響次序是提取溫度（X2）>料液比（X1）>提取時間（X3）。二次項X21、X22和X23的P值<0.000 1，具有極高的顯著性，說明這3因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，響應(yīng)面效應(yīng)顯著。交互項X2X3的P值<0.05，說明提取溫度與提取時間的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著，其余交互項的P值>0.05，說明其交互作用對響應(yīng)值影響均不顯著。

擬合模型相關(guān)系數(shù)R2為0.996 5，即99.65%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋；失擬項檢驗值>0.05，不顯著；用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值的關(guān)系時，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系R=0.24/0.24=1.000，模型的顯著水平P<0.000 1，回歸方差模型極顯著。綜上說明，此方程可靠且與實際擬合良好，試驗誤差較小，可用其替代真實試驗點進行分析和預(yù)測。

43卷5期田廣文等柚皮中抑菌物提取工藝優(yōu)化研究

2.3.3柚皮類檸檬苦素提取工藝的響應(yīng)面分析。

圖1A等高線呈圓形，說明兩因素的交互作用不顯著。從響應(yīng)面圖可看出：隨著提取溫度的上升，曲面較陡，說明提取溫度對提取率影響較顯著；料液比對類檸檬苦素提取率的影響不太顯著，曲面較緩和，提取率經(jīng)過一個先升高后降低的過程。圖1B等高線呈近似圓形，說明兩因素的交互作用不顯著。從響應(yīng)面圖可以看出：曲面較陡，則料液比對類檸檬苦素提取率的影響較顯著；曲面較緩和，則提取時間對提取率的影響不太顯著。圖1C等高線呈橢圓形，說明兩因素的交互較顯著。從響應(yīng)面圖可以看出：曲面較陡，則提取溫度對檸檬苦素提取率的影響較顯著；曲面較緩和并且隨著時間的延長，提取率經(jīng)過一個緩慢升高后稍微減小的過程，則提取時間對提取率的影響不太顯著。

2.3.4類檸檬苦素提取工藝條件優(yōu)化及驗證。

根據(jù)上述回歸模型可預(yù)測理論響應(yīng)值最大時的提取條件為是：料液比數(shù)（X1）0.07，提取溫度（X2）54.26 ℃，提取時間（X3）2.29 h，預(yù)測類檸檬苦素提取率為0.563%?？紤]到實際操作選擇：料液比數(shù)（X1）0.067（即1∶15 g/ml）、提取溫度（X2）55 ℃、提取時間（X3）2.5 h。在此條件下進行3次重復(fù)驗證試驗，提取率分別為0.557%、0.564%、0.561%，平均提取率為0.561%，RSD為0.626%，與理論預(yù)測值相比，差異不顯著（P>0.05），說明預(yù)測模型與實際情況擬合較好，可用于對柚皮類檸檬苦素提取條件進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

圖2兩因素交互作用對類檸檬苦素提取率影響的等高線和響應(yīng)面

3結(jié)論

對柚皮提取類黃酮試驗，通過4因素多水平均勻試驗設(shè)計，建立了模型方程：Y=1.273 79-0.038 79X1-0.007 20X22+0.007 16X1X2+0.000 77X3X4，回歸相關(guān)系數(shù)R=1.000 0。通過DPS軟件分析，得出模型中類黃酮最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25 g/ml、提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h，提取次數(shù)2次。方程預(yù)測類黃酮提取得率為1.210%，而經(jīng)3次驗證試驗柚皮類黃酮平均提取得率為1.211%，可見與模型擬合較好，說明均勻設(shè)計法優(yōu)化類黃酮提取的結(jié)果可靠，所得方程模型適于指導(dǎo)柚皮類黃酮的提取分離。

對以柚皮提取類檸檬苦素試驗，該研究從單因素試驗得知二氯甲烷回流法提取效果較佳。利用Box-Behnken設(shè)計法建立的多元二次方程（模型）為：Y=-3.893 7+30.211 1X1+0.120 1X2+0.107 8X3-0.039 6X1X2+0.451 0X1X3+0.002 5X2X3-204.524 0X21-0.001 1X22-0.060 3X23，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 5。顯著性檢驗得出3個因素對響應(yīng)值影響的順序為：提取溫度（X2）>料液比（X1）>提取時間（X3）。最佳提取工藝是料液比1∶15 g/ml，提取溫度55 ℃，提取時間2.5 h，提取次數(shù)2次。此條件下預(yù)測Y的理論值為0.563%，而3次驗證試驗柚皮類檸檬苦素平均提取得率Y為0.561%，差異不顯著（P>0.05），可見該多元二次方程可用于指導(dǎo)柚皮類檸檬苦素的提取分離。

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責(zé)任編輯李菲菲責(zé)任校對況玲玲