H1N1亞型豬流感診斷方法的研究新進(jìn)展

摘要 2009年，甲型H1N1流感在全球多個(gè)地方豬和人群中暴發(fā)，給人民群眾的生命健康帶來了巨大威脅，給經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。及時(shí)快速的診斷是有效控制疫情大規(guī)模暴發(fā)的最有效途徑之一。近幾年隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，豬流感診斷方法在快速、準(zhǔn)確性方面有了很大提高。對(duì)H1N1豬流感概況及豬流感的診斷方法進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 甲型流感；H1N1；豬流感；診斷方法

中圖分類號(hào) S85 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）05-127-02

基金項(xiàng)目 廣東省科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2010B080701024）；廣東省科技計(jì)劃特定任務(wù)項(xiàng)目（2011B060700075）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201222426）。

作者簡(jiǎn)介 蔡春梅（1962- ），女，廣東揭西人，畜牧師，從事動(dòng)物疫病防控研究。*通訊作者，獸醫(yī)師，從事動(dòng)物疫病診斷和檢測(cè)。

收稿日期 20141225

2009年3月，發(fā)生在墨西哥的人感染豬流感疫情很快在多個(gè)國(guó)家發(fā)生。起初WHO將其稱為“人感染豬流感”，然后又將其更名為“甲型H1N1流感”[1]，由此引起人們對(duì)豬流感病的高度關(guān)注。它是一種新型呼吸道疾病，其病原是人流感病毒基因、禽流感病毒基因和豬流感病毒基因混合的重配株，其造成的疫情來勢(shì)兇猛，危害極大，引起世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。

據(jù)報(bào)道，豬在“禽—豬—人”的種間傳播鏈中，充當(dāng)禽、人、豬流感病毒重組和復(fù)制的“混合器”，扮演著流感病毒中間宿主及多重宿主的作用，豬流感在人和動(dòng)物流感的病原學(xué)、生態(tài)學(xué)及流行病學(xué)中占有舉足輕重的地位。此外，流感病毒依靠抗原漂移與抗原重組機(jī)制不斷發(fā)生變異[1]。及時(shí)快速的診斷是有效控制疫情大規(guī)模暴發(fā)的最有效途徑之一。因此，豬流感（Swine influenza，SI）的診斷具有重要意義，但是在臨床上及時(shí)檢測(cè)還有一定難度，需要借助實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法來進(jìn)行診斷。豬流感的診斷方法研究經(jīng)過多年發(fā)展，已取得新進(jìn)展。筆者結(jié)合一些新文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)H1Nl亞型豬流感的診斷方法進(jìn)行了綜述。

1 豬流感概述

SI是由SIV引起的傳染性疾病。甲型流行性感冒病毒自1918年西班牙流感嚴(yán)重疫情以來，診斷與防控研究取得很好進(jìn)展，已經(jīng)證實(shí)SI在人和動(dòng)物流感的病原學(xué)、生態(tài)學(xué)及流行病學(xué)中占據(jù)重要地位。

1.1 豬流感（SI）是世界性分布的危害豬的傳染性呼吸道病

SI是一種由正粘病毒科豬流感病毒（Swine Influenza Virus，SIV）感染可引起的呼吸道傳染病。SIV可引起不同日齡、性別和品種豬發(fā)病，能引起種豬繁殖障礙、育肥豬增重減慢，也是豬產(chǎn)生免疫抑制的主要誘因。臨床以突發(fā)、咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱、衰竭、迅速康復(fù)或死亡為特征，呈世界性分布和地方性流行。

血凝素（HA）抗原和神經(jīng)氨酸酶（NA）抗原，是劃分流感病毒亞型的依據(jù)。豬群中除了常見的經(jīng)典型H1N1、類禽型H1N1和類人型H3N2流感病毒引起的SI外，由重組病毒H1N2、H1N7、H3N6引起的SI也時(shí)有報(bào)道。目前，造成世界性流行的血清型主要有H1N1、H1N2和H3N2。其中，25%的全世界豬群曾受H1Nl型感染，比較普遍流行。在美國(guó)有30%的豬被H1N1感染過，在美國(guó)中北部豬的感染比例達(dá)51%。1998年，美國(guó)卡羅萊納洲、明尼蘇達(dá)洲、愛荷華洲和德克薩斯洲接種了H1N1SI疫苗的4個(gè)豬場(chǎng)暴發(fā)了嚴(yán)重的SI，令人對(duì)防控好豬流感產(chǎn)生懷疑。

豬流感在我國(guó)不少省市都有豬流感流行，主要亞型是H1N1和H3N2。2000～2003年，從我國(guó)東北、西北、華中、華東、華南及西南地區(qū)20個(gè)省、市、自治區(qū)豬群中分離到116株不同亞型SIV，其中45株為H3N2，25株為H1N1，2株為H1N2，8株為H9N2，2株為H5N1，說明在我國(guó)豬群中流行多種亞型，以H3N2、H1N1為主的流感發(fā)生流行風(fēng)險(xiǎn)大，其診斷與防控壓力很大。

1.2 豬流感與甲型H1Nl流感密切相關(guān)

回顧人類流感史，20世紀(jì)人流感的3次大流行都和SI密切相關(guān)，而1976年1月美國(guó)新澤西洲佛迪狄克斯5名新兵因感染豬源H1N1病毒、1人死于肺炎的事件則是SI人畜共患病史上的里程碑。

人類感染甲型H1Nl流感病毒后的早期癥狀與普通人流感相似，但部分患者病情可迅速發(fā)展，來勢(shì)兇猛，突然高熱，體溫超過39 ℃，可繼發(fā)多臟器功能損傷，甚至導(dǎo)致死亡。最新數(shù)據(jù)表明，確診病例的病死率為0.8%[1]。肺部體征常不明顯，部分患者可聞及濕噦音或有肺部實(shí)變體征。

因此，鑒于豬流感的世界性分布，而且與甲型H1Nl流感流行密切相關(guān)，流感病毒依靠抗原漂移與抗原重組機(jī)制不斷發(fā)生變異，采取科學(xué)、及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷方法用于臨床對(duì)控制疫情大規(guī)模暴發(fā)、流行具有重要意義。

2 流感診斷方法

2.1 傳統(tǒng)方法

傳統(tǒng)方法是指病毒分離方法和抗體檢測(cè)方法等。采集人畜的呼吸道樣品進(jìn)行甲型H1Nl流感的分離，也可動(dòng)態(tài)檢測(cè)雙份血清病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高[2]。病毒分離方法能分離到病毒，但分離病毒的時(shí)間較長(zhǎng)，如雞胚接種需要2周左右時(shí)間，此外，病毒分離后還要用其他方法輔助進(jìn)行鑒定，不適合大量樣本的快速檢測(cè)。血清抗體檢測(cè)方法亦不能在感染初期抗體未產(chǎn)生或者抗體滴度過低時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，而且可能要進(jìn)行2次采血，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同樣也不適用于大規(guī)模樣品的快速檢測(cè)[2]。

2.2 分子生物學(xué)方法

2.2.1 RTPCR方法。

該方法是我國(guó)疾控中心于2009年公布的快速檢測(cè)方法，涉及4對(duì)引物：甲流M基因通用引物FluA、甲流H1N1亞型通用引物H1HA引物、人季節(jié)性流感病毒H1N1亞型通用引物HuH1HA引物、2009年甲流H1N1亞型流感病毒引物SWH1HA1引物。首先提取樣品的病毒RNA，應(yīng)用RTPCR的方法將樣品中與引物互補(bǔ)的基因片段擴(kuò)增后，用瓊脂糖凝膠將擴(kuò)增產(chǎn)物分離。該方法可對(duì)疑似病例的呼吸道樣品進(jìn)行檢測(cè)，篩選甲型H1N1病毒并排除季節(jié)H1N1流感病毒[3]。

2.2.2 多重RTPCR方法。

莫秋華等[4]建立了同時(shí)檢測(cè)A型流感病毒、B型流感病毒及新型甲型H1N1流感病毒的一步法多種RTPCR方法，該方法針對(duì)A型流感病毒的M基因、B型流感病毒的NS基因設(shè)計(jì)通用引物，針對(duì)新型甲型H1N1流感病毒的HA基因設(shè)計(jì)特異性引物。將3對(duì)引物加入同一個(gè)反應(yīng)管中，采用一步法RTPCR的方法擴(kuò)增目的片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。該方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，特異性強(qiáng)，可對(duì)流感疑似病例在4～5 h內(nèi)獲得確診。齊海濤等[5]也建立了同時(shí)檢測(cè)H1N1和H3N2病毒的RTPCR方法。

2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，與常規(guī)PCR相比具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)。

TaqMan熒光探針PCR方法的工作原理為：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入1對(duì)引物的同時(shí)，加入1個(gè)特異性的探針，該探針為1個(gè)寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記1個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和1個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq DNA聚合酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增1條DNA鏈就有1個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成同步。

通過下載暴發(fā)于墨西哥的高致病性豬流感病毒H1N1型基因組序列進(jìn)行同源性分析，借助計(jì)算機(jī)輔助軟件結(jié)合手動(dòng)設(shè)計(jì)特異性引物探針；篩選出特異性引物探針，進(jìn)行靈敏度、穩(wěn)定性等試驗(yàn)研究；優(yōu)化樣本RNA提取方法、優(yōu)化熒光PCR反應(yīng)體系，建立試劑盒的質(zhì)控品；按照《體外生物診斷試劑注冊(cè)管理辦法》的要求進(jìn)行中試，并進(jìn)行應(yīng)用驗(yàn)證，具有操作簡(jiǎn)便、易行且可快速、準(zhǔn)確的得到檢測(cè)結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，可以大規(guī)模地應(yīng)用各類標(biāo)本的檢測(cè)和篩查，有利于豬流感病毒的早期診斷和排查。它具有成本低廉、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，在靈敏度和特異性上將優(yōu)于其他方法。

目前，國(guó)內(nèi)外已有多家實(shí)驗(yàn)室建立了該種方法?？傮w而言，特異性及敏感性較好，可用于甲型H1N1病毒的檢測(cè)[6-10]。

2.2.4 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。

在單一的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)多對(duì)不同病毒的引物及探針，來實(shí)現(xiàn)多種病毒的集成檢測(cè)。Choi等設(shè)計(jì)了同時(shí)檢測(cè)甲型H1N1病毒、季節(jié)流行性病毒和H5亞型病毒的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)結(jié)果可行[11]。

2.2.5 RTSmartAmp法。

為更好地達(dá)到H1N1流感的快速檢測(cè)，近年來日本科研人員發(fā)明了RTSmartAmp方法，此方法包括反轉(zhuǎn)錄和等溫?cái)U(kuò)增2個(gè)步驟，且同時(shí)在一個(gè)管中進(jìn)行，無需病毒RNA的提取及PCR反應(yīng)。該方法的原理是使用激子控制的敏感雜交熒光標(biāo)記引物來檢測(cè)甲型流感H1N1病毒的HA基因，可在40 min內(nèi)出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果，與季節(jié)性A（H1N1）、A型（H3N2）、B型（維多利亞）病毒無交叉反應(yīng)[12]。

2.3 生物傳感器法

近年來，加拿大科研人員也嘗試開發(fā)一種便攜式的低成本儀器—生物傳感器法來檢測(cè)H1N1流感病毒，研究表明生物芯片傳感器能讓非醫(yī)務(wù)人員在1 h內(nèi)檢測(cè)出流感病毒，并且每次檢測(cè)僅需10加元。使用目前的技術(shù)這樣的檢測(cè)需要花費(fèi)好幾百加元。通過一定的校準(zhǔn)，研發(fā)的便攜式設(shè)備還能夠檢測(cè)出某些病原體抗體，從而用于診斷一些傳染性疾病（如SARS、HIV及乙肝等）[13]。

3 小結(jié)與討論

豬流感的診斷方法研究經(jīng)過多年發(fā)展已取得新進(jìn)展，從傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法發(fā)展為基因診斷方法，具有簡(jiǎn)便、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)，為流感的有效防控發(fā)揮重要作用。流感病毒依靠抗原漂移與抗原重組機(jī)制不斷發(fā)生變異，常常給人類帶來防控壓力，給養(yǎng)殖業(yè)造成重創(chuàng)。2009年發(fā)生的甲型H1N1流感以及2013年發(fā)生的新型H7N9禽流感就是很好的案例。2009年以來，各國(guó)研究人員開展各種有效的甲型H1N1流感病毒的檢測(cè)方法，也為2013年的新型H7N9禽流感的檢測(cè)及防控奠定了一定的科學(xué)基礎(chǔ)及技術(shù)支持。隨著

生物技術(shù)的高速發(fā)展，基因芯片技術(shù)、生物傳感器方法有望

進(jìn)一步發(fā)展和成熟應(yīng)用，必將更有利于豬流感的診斷與防控工作開展。

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責(zé)任編輯 陳玉敏 責(zé)任校對(duì) 李巖