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    三氧化二砷介導Notch途徑抑制膠質瘤干細胞增殖

    2015-10-21 18:14:33孫慶喜李丕學
    延邊醫(yī)學 2015年29期
    關鍵詞:三氧化二砷膠質瘤

    孫慶喜 李丕學

    摘要:目的: 探討膠質瘤干細胞在膠質瘤的生成和復發(fā)過程中的作用。方法: 在本研究中我們通過體內(nèi)和體外實驗證實三氧化二砷(As2O3)對膠質瘤干細胞具有抑制作用,利用免疫熒光技術和流式細胞技術,檢測三個膠質瘤細胞系(U87MG,U251MG和U373MG)被As2O3處理72h后Nestin蛋白表達變化;利用軟膠懸浮培養(yǎng)技術檢測腫瘤細胞系神經(jīng)球形成變化;利用免疫缺陷鼠檢測腫瘤移植物生成變化;利用Western印記分析檢測腫瘤細胞系Notch1和Hes1蛋白表達變化。結果: As2O3(2μM)能將膠質瘤細胞系U87MG、U251MG和U373MG中的膠質瘤干細胞分別減少12%、14%和7%,抑制腫瘤移植物在免疫缺陷鼠中生成和U87MG細胞系生成神經(jīng)球,通過免疫印跡分析我們發(fā)現(xiàn)伴隨膠質瘤干細胞的抑制Notch1和Hes1蛋白減少。結論: As2O3對膠質瘤干細胞具有明顯的抑制作用,其機制為Notch途徑活性的下調。

    關鍵詞:膠質瘤;癌干細胞;三氧化二砷

    膠質瘤對放化療具有抵制作用,所以極易復發(fā)。然而,通過對治療抵制機制的研究,一小群膠質瘤干細胞在此過程中發(fā)揮重要作用,從而使膠質瘤的復發(fā)率明顯下降[1,2]。全新的針對膠質瘤干細胞的治療方案受到廣泛關注。盡管最近一些報道稱膠質瘤干細胞對放化療具有抵制作用,但是,通過對信號途徑的調節(jié)一些藥物已經(jīng)表現(xiàn)出對膠質瘤干細胞具有抑制作用[3,4]。例如,cyclopamine通過阻斷Hedgehog信號通路能減少膠質瘤干細胞[5]。

    在本研究中我們檢測了As2O3抑制膠質瘤干細胞的作用。我們的結論是低劑量的As2O3即能抑制膠質瘤干細胞增殖。同時,我們也分析了可能的機制,發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的下調是As2O3抑制膠質瘤干細胞增殖的重要機制。我們的數(shù)據(jù)證實As2O3通過下調Notch信號通路能抑制膠質瘤干細胞的增殖。

    材料和方法

    1.藥物

    As2O3來自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥劑科,應用PBS將As2O3稀釋成五個不同濃度(1,2,4,8和16μM)用于體內(nèi)和體外實驗。

    2.細胞培養(yǎng)

    U87MG,U251MG和U373MG三個膠質瘤細胞系被培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM中。利用細胞計數(shù)系統(tǒng)(CT02,CHEMICON)檢測As2O3對細胞增殖的抑制效果。使用MTT法對細胞增殖分析進行評估[20]。簡單地說,每孔含有100μl培養(yǎng)基的96孔板中加入1×104個細胞,培養(yǎng)4h后加入各種濃度的As2O3,然后培養(yǎng)24-72h吸除培養(yǎng)液加入WST-8(四唑氮鹽),在37℃條件下培養(yǎng)30分鐘后,應用分光光度儀在570nm波長下測量每個孔的吸光光度值,吸光光度值與細胞數(shù)量相對應并不受As2O3的影響,以對照孔為基礎計算細胞的增值率,繪制劑量依賴性曲線和計算半數(shù)致死劑量,實驗被重復三次。

    3.流式細胞儀

    三個膠質瘤細胞系(U87MG,U251MG和U373MG)被As2O3處理72h后,應用Nestin-FITC抗體(R&D System),根據(jù)產(chǎn)品說明書做染色,染色后的細胞應用FACS (BD Cor.)進行分析,數(shù)據(jù)用WinMDI 2.87分析,結果應用ModFit LT 3.1(Verity)證實。

    4.免疫熒光染色

    培養(yǎng)細胞經(jīng)2μM和4μM As2O3 處理72h后,應用4%的多聚甲醛固定15分鐘,0.2% Triton X-100透化10分鐘,蛋白阻斷劑(Thermo)培養(yǎng)5分鐘,1:200稀釋的Nestin 單克隆抗體(MAB5326, CHEMICON)4℃過夜,1:20稀釋的FITC二抗(DakoCytomation) 室溫1h,最后應用DAPI(Sigma)染色,被標記的細胞應用共聚焦顯微鏡分析。

    在凋亡的實驗中細胞被2μM和4μM As2O3 處理24h,應用鼠的Nestin單克隆抗體(CHEMICON)和兔的Caspase-3多克隆抗體(CHEMICON),二抗分別為FITC (CHEMICON) 和PE(Sigma)。

    結 果

    1. As2O3抑制膠質瘤細胞的增殖

    為了確定As2O3是否能抑制膠質瘤細胞增殖,我們檢測了它對U87MG、U251MG和U373MG三個膠質瘤細胞系抑制效果。這些細胞被1、2、4、8和16μM As2O3處理72h,應用MTT法揭示了As2O3的劑量依賴性抑制效果。依據(jù)細胞系的不同其對As2O3的敏感度也不同,半數(shù)致死劑量分別為1.9、2.4和3.0μM(Fig.1)。這些結果展示了As2O3能在體外有效地抑制這三種細胞的增殖,接近半數(shù)致死劑量(2μM和4μM)的As2O3被用于余下的實驗。

    2.As2O3能減少Nestin(+)膠質瘤細胞的百分率

    在U87MG、U251MG和U373MG三個膠質瘤細胞系中,Nestin(+)細胞的百分率分別為89%、88%和98%(Fig.2)。根據(jù)流式細胞儀和免疫染色的結果,經(jīng)不同濃度As2O3(2、4、8和16μM )處理后Nestin(+)腫瘤細胞的百分率明顯下降。代表膠質瘤干細Nestin(+)細胞在U87MG腫瘤細胞系中由89%分別下降到78%(2μM )和68%(4μM),同樣,U251MG由88%下降到76%和64%,U373MG由98%下降到91%和58%。這些結果都說明,在這三個膠質瘤細胞系中As2O3能減少Nestin(+)腫瘤細胞,也就是說As2O3能抑制這三個膠質瘤細胞系的增殖,這些結果也促使我去探尋As2O3抑制膠質瘤干細胞的機制。

    3.神經(jīng)球形成分析

    接下來我們檢測了As2O3在體外抑制腫瘤生成的效果。首先,通過克隆形成分析我們檢測了U87MG是否能形成孤立的神經(jīng)克隆,然后,將U87MG細胞喂養(yǎng)在含軟膠培養(yǎng)皿中,平均每個視野下可形成41個神經(jīng)克?。‵ig.3),同樣數(shù)量經(jīng)2μM和4μMAs2O3處理后的活細胞在同樣軟膠培養(yǎng)條件下,形成神經(jīng)克隆的數(shù)量分別為21個和5個,8μM As2O3能更加明顯地減少神經(jīng)克隆的形成。

    4.腫瘤移植物形成分析

    為了確定As2O3對腫瘤移植物形成的影響,三個膠質瘤細胞系(U87MG、U251MG和U373MG)被As2O3(2μM和4μM)處理72h后,應用臺盼藍染色計數(shù)有活力的細胞,每組50萬個有活力的細胞被注入裸鼠皮下,再對照側有大的腫瘤移植物形成,相反,在處理組側僅有較小或沒有腫瘤移植物形成(Fig.4)。這些結果說明U87MG、U251MG和U373MG細胞的腫瘤形成能力可被低濃度的As2O3所抑制。

    討 論

    最近,與腫瘤起源和生存相關的癌癥干細胞被認為是腫瘤的發(fā)生和復發(fā)的重要原因[2]。而且,一些報道稱這些細胞對傳統(tǒng)的放化療具有抵制作用[3,4]。因此,尋找有效的治療策略成為研究的熱點。低劑量的As2O3能使急性早幼粒細胞白血病患者得到完全緩解[15],抑制APL干細胞增殖[17],所以,As2O3被認為能去除APL中的癌癥干細胞。然而,As2O3是否能去除膠質瘤中的癌癥干細胞仍是未知。在本研究中我們檢測了As2O3對U87MG、U251MG和U373MG三種膠質瘤細胞系的膠質瘤干細胞的抑制效果,發(fā)現(xiàn),在體外低劑量的As2O3能抑制Nestin(+)細胞的增殖,而且,能明顯抑制腫瘤克隆的形成,同時有效地抑制腫瘤移植物在裸鼠體內(nèi)的形成。本實驗第一次說明了As2O3能抑制膠質瘤細胞系中的癌癥干細胞。同時,我們觀察到經(jīng)As2O3處理的腫瘤細胞中Notch1和Hes1蛋白明顯下降,說明Notch信號通路的下調參與了As2O3對膠質瘤干細胞的抑制過程,這些結果都說明As2O3能克服化療抵制對膠質瘤干細胞發(fā)揮抑制作用。

    在體內(nèi)和體外低濃度的As2O3都能抑制U87MG、U251MG和U373MG細胞的增殖說明,此藥物可以被考慮進行進一步的動物實驗,以能真正用于臨床治療膠質瘤患者。而且,本研究第一次說明了As2O3誘導膠質瘤干細胞抑制的機制。下一步實驗我們將證實其它機制的存在,例如Notch信號通路與其它信號通路之間的相互作用以及As2O3誘導的自噬。

    總之,As2O3誘導的Notch信號通路阻滯抑制了膠質瘤干細胞的增殖,因此,As2O3能有效地抑制膠質瘤的生長。這個結論為進一步研究As2O3在臨床上治療膠質瘤提供了理論基礎。

    參考文獻:

    [1] P.B. Dirks, Cancer stem cells and brain tumours, Nature 444 (2006)687688.

    [2] X. Yuan, J. Curtin, Y. Xiong, G. Liu, S. Waschsmann-Hogiu, D.L. Farkas, K.L. Black, J.S. Yu, Isolation of cancer stem cells from adult glioblastoma multiforme, Oncogene 23 (2004) 9392–9400.

    [3] S.D. Bao, Q.L. Wu, R.E. McLendon, Y.L. Hao, Q. Shi, A.B. Hjelmeland, M.W. Dewhirst, D.D. Bigner, J.N. Rich, Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response, Nature 444 (2006) 756–760.

    [4] A.J. Ghods, D. Irvin, G. Liu, X. Yuan, I.R. Abdulkadir, P. Tunici, B.Konda, S. Wachsmann-Hogiu, K.L. Black, J.S. Yu, Spheres isolated from 9L gliosarcoma rat cell line possess chemoresistant and aggressive cancer stem-like cells, Stem Cells 25 (2007) 1645–1653.

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