三氧化二砷介導Notch途徑抑制膠質瘤干細胞增殖

孫慶喜 李丕學

摘要：目的： 探討膠質瘤干細胞在膠質瘤的生成和復發(fā)過程中的作用。方法： 在本研究中我們通過體內(nèi)和體外實驗證實三氧化二砷（As2O3）對膠質瘤干細胞具有抑制作用，利用免疫熒光技術和流式細胞技術，檢測三個膠質瘤細胞系（U87MG，U251MG和U373MG）被As2O3處理72h后Nestin蛋白表達變化；利用軟膠懸浮培養(yǎng)技術檢測腫瘤細胞系神經(jīng)球形成變化；利用免疫缺陷鼠檢測腫瘤移植物生成變化；利用Western印記分析檢測腫瘤細胞系Notch1和Hes1蛋白表達變化。結果： As2O3（2μM）能將膠質瘤細胞系U87MG、U251MG和U373MG中的膠質瘤干細胞分別減少12%、14%和7%，抑制腫瘤移植物在免疫缺陷鼠中生成和U87MG細胞系生成神經(jīng)球，通過免疫印跡分析我們發(fā)現(xiàn)伴隨膠質瘤干細胞的抑制Notch1和Hes1蛋白減少。結論： As2O3對膠質瘤干細胞具有明顯的抑制作用，其機制為Notch途徑活性的下調。

關鍵詞：膠質瘤；癌干細胞；三氧化二砷

膠質瘤對放化療具有抵制作用，所以極易復發(fā)。然而，通過對治療抵制機制的研究，一小群膠質瘤干細胞在此過程中發(fā)揮重要作用，從而使膠質瘤的復發(fā)率明顯下降[1，2]。全新的針對膠質瘤干細胞的治療方案受到廣泛關注。盡管最近一些報道稱膠質瘤干細胞對放化療具有抵制作用，但是，通過對信號途徑的調節(jié)一些藥物已經(jīng)表現(xiàn)出對膠質瘤干細胞具有抑制作用[3，4]。例如，cyclopamine通過阻斷Hedgehog信號通路能減少膠質瘤干細胞[5]。

在本研究中我們檢測了As2O3抑制膠質瘤干細胞的作用。我們的結論是低劑量的As2O3即能抑制膠質瘤干細胞增殖。同時，我們也分析了可能的機制，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的下調是As2O3抑制膠質瘤干細胞增殖的重要機制。我們的數(shù)據(jù)證實As2O3通過下調Notch信號通路能抑制膠質瘤干細胞的增殖。

材料和方法

1.藥物

As2O3來自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥劑科，應用PBS將As2O3稀釋成五個不同濃度（1，2，4，8和16μM）用于體內(nèi)和體外實驗。

2.細胞培養(yǎng)

U87MG，U251MG和U373MG三個膠質瘤細胞系被培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM中。利用細胞計數(shù)系統(tǒng)（CT02，CHEMICON）檢測As2O3對細胞增殖的抑制效果。使用MTT法對細胞增殖分析進行評估[20]。簡單地說，每孔含有100μl培養(yǎng)基的96孔板中加入1×104個細胞，培養(yǎng)4h后加入各種濃度的As2O3，然后培養(yǎng)24-72h吸除培養(yǎng)液加入WST-8（四唑氮鹽），在37℃條件下培養(yǎng)30分鐘后，應用分光光度儀在570nm波長下測量每個孔的吸光光度值，吸光光度值與細胞數(shù)量相對應并不受As2O3的影響，以對照孔為基礎計算細胞的增值率，繪制劑量依賴性曲線和計算半數(shù)致死劑量，實驗被重復三次。

3.流式細胞儀

三個膠質瘤細胞系（U87MG，U251MG和U373MG）被As2O3處理72h后，應用Nestin-FITC抗體（R&D System），根據(jù)產(chǎn)品說明書做染色，染色后的細胞應用FACS （BD Cor.）進行分析，數(shù)據(jù)用WinMDI 2.87分析，結果應用ModFit LT 3.1（Verity）證實。

4.免疫熒光染色

培養(yǎng)細胞經(jīng)2μM和4μM As2O3 處理72h后，應用4%的多聚甲醛固定15分鐘，0.2% Triton X-100透化10分鐘，蛋白阻斷劑（Thermo）培養(yǎng)5分鐘，1：200稀釋的Nestin 單克隆抗體（MAB5326， CHEMICON）4℃過夜，1：20稀釋的FITC二抗（DakoCytomation） 室溫1h，最后應用DAPI（Sigma）染色，被標記的細胞應用共聚焦顯微鏡分析。

在凋亡的實驗中細胞被2μM和4μM As2O3 處理24h，應用鼠的Nestin單克隆抗體（CHEMICON）和兔的Caspase-3多克隆抗體（CHEMICON），二抗分別為FITC （CHEMICON） 和PE（Sigma）。

結 果

1. As2O3抑制膠質瘤細胞的增殖

為了確定As2O3是否能抑制膠質瘤細胞增殖，我們檢測了它對U87MG、U251MG和U373MG三個膠質瘤細胞系抑制效果。這些細胞被1、2、4、8和16μM As2O3處理72h，應用MTT法揭示了As2O3的劑量依賴性抑制效果。依據(jù)細胞系的不同其對As2O3的敏感度也不同，半數(shù)致死劑量分別為1.9、2.4和3.0μM（Fig.1）。這些結果展示了As2O3能在體外有效地抑制這三種細胞的增殖，接近半數(shù)致死劑量（2μM和4μM）的As2O3被用于余下的實驗。

2.As2O3能減少Nestin（+）膠質瘤細胞的百分率

在U87MG、U251MG和U373MG三個膠質瘤細胞系中，Nestin（+）細胞的百分率分別為89%、88%和98%（Fig.2）。根據(jù)流式細胞儀和免疫染色的結果，經(jīng)不同濃度As2O3（2、4、8和16μM ）處理后Nestin（+）腫瘤細胞的百分率明顯下降。代表膠質瘤干細Nestin（+）細胞在U87MG腫瘤細胞系中由89%分別下降到78%（2μM ）和68%（4μM），同樣，U251MG由88%下降到76%和64%，U373MG由98%下降到91%和58%。這些結果都說明，在這三個膠質瘤細胞系中As2O3能減少Nestin（+）腫瘤細胞，也就是說As2O3能抑制這三個膠質瘤細胞系的增殖，這些結果也促使我去探尋As2O3抑制膠質瘤干細胞的機制。

3.神經(jīng)球形成分析

接下來我們檢測了As2O3在體外抑制腫瘤生成的效果。首先，通過克隆形成分析我們檢測了U87MG是否能形成孤立的神經(jīng)克隆，然后，將U87MG細胞喂養(yǎng)在含軟膠培養(yǎng)皿中，平均每個視野下可形成41個神經(jīng)克?。‵ig.3），同樣數(shù)量經(jīng)2μM和4μMAs2O3處理后的活細胞在同樣軟膠培養(yǎng)條件下，形成神經(jīng)克隆的數(shù)量分別為21個和5個，8μM As2O3能更加明顯地減少神經(jīng)克隆的形成。

4.腫瘤移植物形成分析

為了確定As2O3對腫瘤移植物形成的影響，三個膠質瘤細胞系（U87MG、U251MG和U373MG）被As2O3（2μM和4μM）處理72h后，應用臺盼藍染色計數(shù)有活力的細胞，每組50萬個有活力的細胞被注入裸鼠皮下，再對照側有大的腫瘤移植物形成，相反，在處理組側僅有較小或沒有腫瘤移植物形成（Fig.4）。這些結果說明U87MG、U251MG和U373MG細胞的腫瘤形成能力可被低濃度的As2O3所抑制。

討 論

最近，與腫瘤起源和生存相關的癌癥干細胞被認為是腫瘤的發(fā)生和復發(fā)的重要原因[2]。而且，一些報道稱這些細胞對傳統(tǒng)的放化療具有抵制作用[3，4]。因此，尋找有效的治療策略成為研究的熱點。低劑量的As2O3能使急性早幼粒細胞白血病患者得到完全緩解[15]，抑制APL干細胞增殖[17]，所以，As2O3被認為能去除APL中的癌癥干細胞。然而，As2O3是否能去除膠質瘤中的癌癥干細胞仍是未知。在本研究中我們檢測了As2O3對U87MG、U251MG和U373MG三種膠質瘤細胞系的膠質瘤干細胞的抑制效果，發(fā)現(xiàn)，在體外低劑量的As2O3能抑制Nestin（+）細胞的增殖，而且，能明顯抑制腫瘤克隆的形成，同時有效地抑制腫瘤移植物在裸鼠體內(nèi)的形成。本實驗第一次說明了As2O3能抑制膠質瘤細胞系中的癌癥干細胞。同時，我們觀察到經(jīng)As2O3處理的腫瘤細胞中Notch1和Hes1蛋白明顯下降，說明Notch信號通路的下調參與了As2O3對膠質瘤干細胞的抑制過程，這些結果都說明As2O3能克服化療抵制對膠質瘤干細胞發(fā)揮抑制作用。

在體內(nèi)和體外低濃度的As2O3都能抑制U87MG、U251MG和U373MG細胞的增殖說明，此藥物可以被考慮進行進一步的動物實驗，以能真正用于臨床治療膠質瘤患者。而且，本研究第一次說明了As2O3誘導膠質瘤干細胞抑制的機制。下一步實驗我們將證實其它機制的存在，例如Notch信號通路與其它信號通路之間的相互作用以及As2O3誘導的自噬。

總之，As2O3誘導的Notch信號通路阻滯抑制了膠質瘤干細胞的增殖，因此，As2O3能有效地抑制膠質瘤的生長。這個結論為進一步研究As2O3在臨床上治療膠質瘤提供了理論基礎。

參考文獻：

[1] P.B. Dirks， Cancer stem cells and brain tumours， Nature 444 （2006）687688.

[2] X. Yuan， J. Curtin， Y. Xiong， G. Liu， S. Waschsmann-Hogiu， D.L. Farkas， K.L. Black， J.S. Yu， Isolation of cancer stem cells from adult glioblastoma multiforme， Oncogene 23 （2004） 9392–9400.

[3] S.D. Bao， Q.L. Wu， R.E. McLendon， Y.L. Hao， Q. Shi， A.B. Hjelmeland， M.W. Dewhirst， D.D. Bigner， J.N. Rich， Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response， Nature 444 （2006） 756–760.

[4] A.J. Ghods， D. Irvin， G. Liu， X. Yuan， I.R. Abdulkadir， P. Tunici， B.Konda， S. Wachsmann-Hogiu， K.L. Black， J.S. Yu， Spheres isolated from 9L gliosarcoma rat cell line possess chemoresistant and aggressive cancer stem-like cells， Stem Cells 25 （2007） 1645–1653.