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    CD24在人胚腎上皮細(xì)胞Hek293中的表達(dá)及檢測

    2012-04-29 20:34:34敖翔章清武強(qiáng)賀樂奇張群峰柯文才彭志海
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2012年29期
    關(guān)鍵詞:表達(dá)

    敖翔 章清 武強(qiáng) 賀樂奇 張群峰 柯文才 彭志海

    [摘要] 目的 構(gòu)建含有CD24基因的重組質(zhì)粒,在人胚腎上皮細(xì)胞Hek293中表達(dá)出具有免疫原性的抗原。方法 用PCR方法擴(kuò)增CD24基因,克隆到載體pYD5-hFC中,獲得重組質(zhì)粒pYD5-CD24,轉(zhuǎn)化DH10α感受態(tài)細(xì)胞中,挑選克隆抽取質(zhì)粒,以脂質(zhì)體介導(dǎo)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hek293細(xì)胞,72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,Western-Blot分析鑒定。結(jié)果 構(gòu)建了含有CD24基因的重組質(zhì)粒,并在人胚腎上皮細(xì)胞Hek293中獲得帶有hFC標(biāo)簽的CD24蛋白。結(jié)論 本研究成功表達(dá)出了具有免疫原性的CD24蛋白。

    [關(guān)鍵詞] CD24;表達(dá);Western

    [中圖分類號] R741[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B[文章編號] 1673-9701(2012)29-0047-02

    CD24基因編碼唾液酸糖蛋白錨定在細(xì)胞表面糖基磷脂酰肌醇鏈上,在成熟的粒細(xì)胞和許多B細(xì)胞中都有表達(dá)[1],它作為黏附分子對調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、增殖及侵襲等均具有重要作用[2],且其高表達(dá)及表達(dá)模式與患者生存率及預(yù)后密切相關(guān),是多種腫瘤有價值的診斷和預(yù)后指標(biāo)[3]。

    真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水平高,表達(dá)產(chǎn)物可進(jìn)行翻譯后加工,其抗原性、免疫原性和功能等生物活性與天然蛋白相似等特點,被廣泛應(yīng)用于各種不同外源基因的表達(dá)。本文以真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CD24基因,對表達(dá)產(chǎn)物的特異性進(jìn)行鑒定,并對核蛋白的免疫原性進(jìn)行初步研究,為CD24基因工程亞單位疫苗的研制及診斷抗原的研究做進(jìn)一步的探索。

    1 材料與方法

    1.1材料

    CD24模版購自美國open biosysterms公司,DH10α感受態(tài)細(xì)胞自己制備,限制性內(nèi)切酶HindIII、BamHI購自NEB公司,T4連接酶、 Taq DNA聚合酶購自美國TAKARA公司,Hek293細(xì)胞株、F17培養(yǎng)基、F68、脂質(zhì)體cellfectine、抽質(zhì)粒試劑盒均購自invitrogen公司,Anti-CD24鼠抗購自Abcam公司,HRP標(biāo)記羊抗鼠IgGFc購自Sigma。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行,具體步驟如下,Hek293細(xì)胞培養(yǎng)基:F17無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件:27℃,5%CO2。懸浮培養(yǎng):細(xì)胞接種到無菌的三角瓶置于恒溫?fù)u床培養(yǎng),轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/min,加入1%的F68,懸浮細(xì)胞密度一般維持在(0.5×106~1×106)cells/mL之間,一般傳代(2~3)次/周。

    1.3 目的基因擴(kuò)增

    根據(jù)CD24模板,PCR擴(kuò)增全長基因。上游引物P1為5GCCGTCTCGGATCCATGGGCAGAGCAATGGTGGC 3,5端加上BamHI酶切位點;下游引物P2為5GCCGTCTCAAGCTTAAGAGTAGAGATGCAGAAGAG 3,5端加上HindIII酶切位點。擴(kuò)增片斷為240 bp,含有完整的CD24基因,引物由南京金思特科技有限公司合成。

    1.4重組質(zhì)粒構(gòu)建

    將PCR產(chǎn)物CD24經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切,酶切條件:37℃,2 h,酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離回收(按說明書操作),回收的目的片段與pYD5載體連接,連接產(chǎn)物pYD5-CD24熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH10α,涂布LB平板(平板中含有Amp),37℃培養(yǎng)過夜,挑獨立的克隆接種于10 mL LB培養(yǎng)基中(Amp)震蕩培養(yǎng)過夜。

    1.5酶切及測序

    收集細(xì)胞抽質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,1 mL送測序,1.5 mL保種。若測序正確,將保存菌種擴(kuò)大培養(yǎng)抽質(zhì)粒(按Invitrogen公司試劑盒說明書操作)。

    1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)分析

    轉(zhuǎn)染在6孔板中進(jìn)行,當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到1×106 cells/mL時,利用脂質(zhì)體(cellfectine)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后72 h左右收集細(xì)胞培養(yǎng)上清加入 loadingbuffer制得裂解液,根據(jù)Western bloting常規(guī)操作做WB檢測。一抗:CD24單克隆抗體。二抗:是HRP標(biāo)記羊抗鼠IgGFc。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的基因擴(kuò)增結(jié)果

    PCR擴(kuò)增出的CD24基因,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到一條大約240 bp的特異性條帶,與預(yù)期片段大小相符(圖1)。

    圖1 CD24的PCR分析

    1:2000 marker;2:CD24

    2.2 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

    重組質(zhì)粒pYD5-CD24轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10α,在含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)板上挑取獨立克隆培養(yǎng),抽出質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,酶切結(jié)果如圖2。酶切后得到大約6 kb和240 bp兩片段,分別與pYD5載體和CD24基因分子質(zhì)量一致。測序結(jié)果證明載體pYD5和CD24基因接頭連接處正確,大小和讀碼框架正確完整。

    2.3 Western bloting分析結(jié)果

    Western bloting結(jié)果如圖3,轉(zhuǎn)入CD24的Hek293細(xì)胞表達(dá)得到一條37 kD左右的帶,與預(yù)測的37.4 kD相符,說明表達(dá)出來的真核蛋白能與CD24單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。

    3 結(jié)論

    研究發(fā)現(xiàn)CD24可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖,同時激活Raf-ERK通路及p38MAPK激酶[5],也與卵巢上皮性腫瘤惡性程度相關(guān)[6],此外與乳腺癌標(biāo)本中CD44+CD24-細(xì)胞E-鈣黏連水平明顯下降[7]。CD24的表達(dá)與胃癌腫瘤病理學(xué)分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性,同時CD24的異常表達(dá)可能與胃癌的早期發(fā)生有關(guān)[8]。CD24可能與食管鱗癌(ESCC)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LNM)相關(guān)[9]。樹突狀細(xì)胞受脂多糖刺激后CD24表達(dá)顯著增高,這有利于DC-T細(xì)胞簇的形成及抗原的遞呈,從而導(dǎo)致DC免疫功能的增強(qiáng)[10]。CD24表達(dá)可能是反映前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展、生物學(xué)行為和預(yù)后的重要癌干細(xì)胞標(biāo)記物[11]。CD24在病理分級高的胰腺癌中表達(dá)高于分級低者,且惡性程度高的原發(fā)癌患者CD24表達(dá)明顯增強(qiáng)[12]。這些提示CD24在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[13]。

    本研究采用真核表達(dá)系統(tǒng)在Hek293細(xì)胞中表達(dá)重組CD24蛋白,真核系統(tǒng)與大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)相比,能更好地保持蛋白的免疫原性,且pYD5載體為CD24加入hFC標(biāo)簽以利于蛋白的純化。用Western Blot方法進(jìn)行檢測,確定在Hek293細(xì)胞中表達(dá)出了真核蛋白,分子量約為37.4 kD,與預(yù)計的結(jié)果相符,且與CD24單克隆抗體發(fā)生良好的免疫反應(yīng),這表明重組核蛋白保持了天然核蛋白的免疫原性,為進(jìn)一步研究該蛋白奠定了基礎(chǔ)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2012-09-03)

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