球囊霉屬3種AM真菌對香蕉枯萎病的影響

梁昌聰 劉磊 郭立佳 楊臘英 王國芬 張建華 黃俊生

摘 要 以巴西蕉（Musa AAA Giant Cavendish cv. Baxi）試管苗為材料，在溫室盆栽條件下研究了叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhiza， AM）真菌Glomus mosseae（Nicol. & Gerd.）Gerdemann、G. aggregatum（Schenck & Smith）Koske和G. etunicatum Becker & Gerdemann對香蕉枯萎?。╢usarium wilt of banana）的影響。結果表明：巴西蕉植株的菌根侵染率為23.13%～44.72%，接種AM真菌促進了巴西蕉植株的營養(yǎng)生長，顯著地增加地上部分和根系的干重，顯著減少根際土壤周圍鐮刀菌數(shù)量，對植株的株高、葉片數(shù)和葉片長度略有提高；降低香蕉枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)，從而減輕香蕉枯萎病的危害。單接種AM真菌顯著促進巴西蕉植株地上和根部分P和K含量和吸收量；與單接種鐮刀菌的植株相比，雙接種混合AM真菌與鐮刀菌處理能顯著提高植株地上部分P的含量和吸收量及根系部分K的含量和吸收量。結果還表明，混合接種劑的生長防病效果好于單一接種劑。

關鍵詞 叢枝菌根真菌；巴西蕉；香蕉枯萎??；尖孢鐮刀菌

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）引起的一種毀滅性的土傳病害，已嚴重危害到香蕉的生產及香蕉產業(yè)。目前，單純采用化學藥劑防治香蕉枯萎病的效果并不理想[1]，并且隨著大量使用化學農藥產生了環(huán)境污染、農藥殘留及土壤微生物群落結構失衡等令人擔憂的問題[2]；因此很多學者把注意力放到生物防治上。叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌作為一種重要的植病生防菌一直受到普遍關注。AM真菌能夠與陸地上85%以上的植物建立共生關系，形成叢枝菌根[3]。

由于AM真菌侵染的是植物根系，因此，對植物真菌病害的影響大多涉及植物的土傳病害。研究表明，植物根系中從枝菌根的形成確實可以影響植物對土傳病害的抗性耐性[4]。在園藝、農作物和林業(yè)生產中，AM真菌既可作為生物肥料，又可作為生防藥劑，具有很大的應用潛力。研究表明AM真菌可減輕土傳病原鐮刀菌對番木瓜[5]、番茄[6]、黃瓜[7]、棉花[8-9]、蘆筍[10-12]、菜豆[13]等作物所造成的危害。然而目前對AM真菌與香蕉枯萎病的關系研究幾乎沒有；AM真菌在香蕉上的研究主要集中在AM真菌減輕線蟲對香蕉造成的危害[14]，真菌促進香蕉養(yǎng)分吸收，提高光合速率和水分的利用效率，促進植株生長，提高產量等方面[15-17]。因此，本研究在溫室盆栽條件下探索AM真菌對香蕉枯萎病的影響， 為AM真菌在香蕉病害防治上的田間試驗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香蕉苗 由中國熱帶農業(yè)科學院種苗組培中心提供的巴西蕉（Musa AAA Giant Cavendish cv. Baxi）試管苗。

1.1.2 AM真菌 Glomus mosseae（Nicol. & Gerd.）Gerdemann（GM-df05）分離自海南東方香蕉地，為中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所微生物資源研究與利用課題組保存。Glomus aggregatum （Schenck & Smith） Koske（編號：BGC HK02D）；Glomus etunicatum Becker&Gerdemann（編號：BGC HEN 02A）購自北京市農林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所。這3個AM真菌都以三葉草（Trifolium repens L.）為宿主，用沸石加河沙擴繁，其孢子和菌根根段作為接種物。

1.1.3 病原菌 為尖孢鐮刀菌古巴轉化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）（FOC4-B2），為中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所微生物資源研究與利用課題組分離篩選保存菌株。

1.1.4 栽培容器 包括育苗杯[10 cm（底直徑）×10 cm]和塑料盆[21 cm（底直徑）×22 cm]，育苗杯中的栽培介質為椰糠，塑料盆中的栽培介質為滅菌土壤。

1.1.5 椰糠和土壤 高溫滅菌（121 ℃，1 h，間歇滅菌2次）后備用， 土壤理化性質為pH值6.10，有機質含量為17.90 g/kg，堿解氮0.03 g/kg，有效磷0.02 g/kg，速效鉀0.11 g/kg，全氮0.91 g/kg，全磷0.26 g/kg，全鉀0.95 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗在中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所日光溫室大棚內進行。試驗共設置5個處理：①對照CK：幼苗生長過程中既不接種AM真菌也不接種Foc病原菌；②Foc：育苗時不接種AM真菌，幼苗移栽花盆后接種Foc病原菌；③G.m：育苗時單一接種AM真菌G.mosseae；④G.m+Foc：育苗時單一接種AM真菌G.mosseae，幼苗移栽花盆后接種Foc病原菌；⑤G.混：育苗時混合接種AM真菌G.mosseae、G.aggregatum、G.etunicatum（質量比為1 ∶ 1 ∶ 1）；⑥G. 混+Foc：育苗時混合接種AM真菌G.mosseae、G.aggregatum、G.etunicatum（質量比為1 ∶ 1 ∶ 1），幼苗移栽花盆后接種Foc病原菌；每處理10盆。

處理③④⑤⑥AM真菌接種劑按10%的比例（質量比）與育苗杯的栽培介質混合后備用；處理①②則加10%的比例（質量比）滅菌接種劑與育苗杯的栽培介質混合后備用。將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，仔細洗凈根系上的瓊脂，挑選大小一致的幼苗90株（每個處理15株）移栽到育苗杯中，根據(jù)天氣情況用小型噴霧器向葉面噴射霧狀水1-3次/d，保持栽培介質和葉面的濕度。幼苗生長5周后，移栽到塑料盆里。分別從6個處理的成活幼苗中選擇生長一致的每個處理各10棵植株，帶栽培物質移栽到塑料盆中，每盆裝入3 kg滅菌土，每盆1株。

1.2.2 尖孢鐮刀菌的接種 從培養(yǎng)7 d的FOC4-B2菌株平板上挑一塊菌餅接種于PDB（土豆葡萄糖培養(yǎng)液）培養(yǎng)液中，置于180 r/min 轉速的搖床中28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d，過濾除去菌絲，將孢子液離心沉淀，再用無菌水重懸孢子，并將孢子懸浮液濃度調至約106 cfu/mL。各取100 mL的FOC4-B2孢子懸浮液分別與3 kg滅菌土壤混勻制成病土，裝于塑料盆中。不接種病原菌處理則澆入等量滅菌蒸餾水。

1.2.3 指標測定 移栽生長12周后，植株收獲，各處理隨機取5盆，測定植株葉片數(shù)和葉片長度；并且用特異選擇培養(yǎng)基稀釋分離法測定選取的巴西蕉根圍土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量[18]；取出植株，分離地上部和根系，用堿解離、酸性品紅染色法[19]進行處理。把染色的根樣切成1～2 cm的小根段，然后選取20～30個小根段，用十字交叉法[20]在×200倍的顯微鏡下觀察AMF在各根樣中的感染情況。每一樣本觀察150個交叉，記錄根中菌絲、泡囊、叢枝的感染情況。植株在70 ℃烘干至恒重，測定根系和地上部干重，計算根冠比。植株經消煮后，分別用凱氏定氮法、釩鉬黃比色法和火焰光度計測定N、P、K含量[21]。

1.2.4 香蕉病情指數(shù)和防病效果 香蕉枯萎病先從根部維管束侵入，然后侵害下部葉片葉鞘維管束，并由下而上不斷擴展，因此根據(jù)這個特征將香蕉枯萎病分為以下5個標準：

0級：植株無枯黃癥狀；

1級：植株下部葉片出現(xiàn)輕微的枯黃癥狀，嫩葉完好，少部分根系輕微褐變，莖部出現(xiàn)水漬狀褐變；

2級：植株下部葉片出現(xiàn)明顯的枯黃癥狀，但嫩葉完好，根系出現(xiàn)褐變，莖部和假莖部出現(xiàn)水漬狀褐變；

3級：整個植株出現(xiàn)枯黃癥狀，根系褐變腐爛，莖部和假莖部褐變連片，少數(shù)葉柄出現(xiàn)紅褐；

4級：植株出現(xiàn)枯萎死亡癥狀，根系嚴重褐變腐爛。

植物病情調查：病情指數(shù)[22]

病情指數(shù)=∑

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，應用Tukey HSD方法進行多重比較，顯著水平取0.05（p≤0.05）。

2 結果與分析

2.1 AM真菌對巴西蕉的侵染率及對香蕉枯萎病的影響

表1數(shù)據(jù)表明，接種AM真菌的4個處理中植株根系均被侵染。不論是接種單一AM真菌還是接種混合AM真菌，在先接種AM真菌后接種Foc病原菌時，AM真菌的侵染率則低于單接種AM真菌處理的植株，說明Foc病原菌能抑制AM真菌對巴西蕉根系的侵染和發(fā)育。AM真菌與Foc病原菌雙接種的植株根際土壤Foc病原菌數(shù)量顯著低于單接種Foc病原菌植株，并且混合AM真菌與Foc病原菌雙接種的植株根際土壤Foc病原菌數(shù)量最少（表1）。

同一種接種方式處理的混合接種劑處理的菌絲侵染率顯著高于單一接種劑，如處理⑤G.混的菌絲侵染率44.72%高于處理③G.m 33.34%，表明混合接種劑能提高AM真菌對植株的侵染水平。從表1可知，接種AM真菌能顯著降低香蕉枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)， 不同AM真菌的效應存在差異，混合接種劑處理的效果優(yōu)于單一接種劑。

2.2 AM真菌和尖孢鐮刀菌對巴西蕉生長的影響

接種AM真菌處理的植株干重、根冠比顯著大于其它處理。其中， 以單接種G.混促進香蕉生長的效果最好（表2）。AM真菌與Foc病原菌雙接種的植株干重均顯著高于單接種Foc病原菌植株，接種AM真菌的處理的植株干重顯著高于對照，而單接種Foc病原菌處理的植株干重、株高、葉片數(shù)、葉片長度最小（表2），這與該病菌對巴西蕉的致病性有關。

接種AM真菌對巴西蕉植株的地上部的生長產生一定的影響。對于株高、葉片數(shù)和葉片長度而言， 單接種AM真菌處理比CK有所增加（表2），但是差異未達到顯著水平；雙接種AM真菌和病原菌處理比單接種Foc有所增加（表2），但是差異也未達到顯著水平。

2.3 AM對巴西蕉植株礦質營養(yǎng)吸收的影響

從表3可以看出，與CK相比，單接種AM真菌能顯著提高巴西蕉處理地上部分P和K的含量和吸收量；混合AM真菌與Foc病原菌雙接種植株地上部分P含量和吸收量均顯著高于單接種Foc病原菌植株。

從表4可以看出，單接種AM真菌的巴西蕉處理植根部P、K含量和N、P、K吸收量均顯著高于CK。AM真菌與Foc病原菌雙接種的植株根系部分K含量均顯著高于單接種Foc病原菌植株，并且雙接種中的G. 混植株根系部分K吸收量顯著高于單接種Foc病原菌植株。

3 討論與結論

AM真菌能夠顯著促進巴西蕉生長，而尖孢鐮刀菌則抑制其生長。當AM真菌與尖孢鐮刀菌雙接種時，AM真菌能顯著降低香蕉枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，提高植株生長量，這與AM真菌可以通過改善植株礦質營養(yǎng)、水分狀況等促進植株生長健壯，從而提高其抗病性[4]是一致的。這一結果表明，AM真菌促進植物生長的效應在其降低土傳病害發(fā)病程度過程中具有一定作用。關于AM真菌與Foc病原菌的關系，李敏等[23]在研究AM真菌與西瓜枯萎病的關系時發(fā)現(xiàn)， 接種AM真菌能顯著減少西瓜根內和根圍土壤中鐮刀菌群體數(shù)量及其對根系的侵染率。本研究也發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌顯著減少巴西蕉根圍土壤中Foc病菌數(shù)量。

由于AM真菌的防治效果受到AM真菌的種類、病原菌的毒力及外界環(huán)境條件等諸多因素的影響，因此AM真菌對土傳病害的防治效果很難一概而論。其中，病原菌侵入植物體時，AM真菌和植物建成共生體（菌根）的狀況是影響AM真菌防治效果的一個重要因素。有研究表明，AM真菌對植物抗病性的誘導依賴于較高（大于50%）的菌根侵染率[24-25]。但是對于菌根侵染率高低的界定往往因植物基因型、AM真菌種類、接種病原菌時間及取樣時間等而不同。具體到本研究，巴西蕉育苗時接種AM真菌，7周后移栽到塑料盆進行盆栽同時接種病原菌，幼苗生長3個月后，盡管菌根侵染率不到50%，但共生體已初步建成，能對病原菌的侵害進行有效抵制，降低香蕉枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)。

研究表明，當植株根系受到病原侵害時，菌根化植株可利用分布于土壤中的菌絲提高植物根系的吸收表面積，同時，根細胞內叢枝的形成維持了根細胞的活性，進而使得受病原侵害的植物根系功能在一定程度上得到了改善[26]。本研究中，在先接種AM真菌后接種Foc病原菌的條件下，育苗時接種AM真菌可促進巴西蕉根系生長，且AM真菌的促生作用最終表現(xiàn)為植株地上部分和根系干重的增加。由此看來，接種AM真菌后巴西蕉干重的增加間接補償了因病原菌侵入而對植株根系造成的損傷。

Hu等[27]的試驗發(fā)現(xiàn)，與單一菌種的接種劑相比，混合接種劑促進黃瓜生長和降低黃瓜枯萎病的效果更好。本研究結果也表明混合接種劑對巴西蕉的生長防病效果好于單一接種劑。這可能是因為混合接種劑處理的菌絲感染率比單一接種劑處理的高，導致菌絲密度大，所以吸收能力更強。

AM真菌促進植株生長的原因在于養(yǎng)分吸收得到增強。一般而言，在灌溉良好、養(yǎng)分適宜的土壤中，AM真菌對植株的P元素有很好的促進作用，而對N元素和K元素的促進作用不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)在3種礦質營養(yǎng)中，巴西蕉地上和根部的P、K含量和吸收量因接種AM真菌而明顯提高，更有利于巴西蕉的生長，因為巴西蕉是需K量較高的果樹之一。

綜上所述，AM真菌與感病巴西蕉可以形成共生體，且促進植株的生長，降低植株根系周圍Foc病原菌數(shù)量及香蕉枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)。由于AM真菌對香蕉枯萎病的顯著防效，因此，可將農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中豐富的AM真菌資源應用于巴西蕉的育苗生產環(huán)節(jié)，為大田中香蕉枯萎病的防治提供一條經濟有效的生防途徑。

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