金匱腎氣丸對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠睪丸轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1和細(xì)胞色素P—19表達(dá)的影響

張曉紅等

摘要：目的 觀察金匱腎氣丸對(duì)腎陽(yáng)虛及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）受體阻滯后大鼠轉(zhuǎn)化TGF-β1、細(xì)胞色素P-19（CYP19）、性激素水平和精子質(zhì)量的影響，并探討其治療男性不育的作用機(jī)制。方法 將40只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、阻滯劑組、金匱組，每組10只。除正常組外，腺嘌呤混懸液灌胃制備腎陽(yáng)虛不育模型。正常組給予生理鹽水灌胃，阻滯劑組注入大鼠睪丸間質(zhì)TGF-β1受體阻滯劑，金匱組給予金匱腎氣丸水煎劑灌胃。經(jīng)尾靜脈采血并摘取睪丸，采用免疫組化法、放射免疫法和電鏡觀察，檢測(cè)睪丸TGF-β1和CYP19的表達(dá)、性激素水平、精子密度和活率及睪丸形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 與正常組比較，模型組TGF-β1表達(dá)水平升高、CYP19表達(dá)水平降低（P<0.05）；與模型組比較，金匱組和阻滯劑組TGF-β1表達(dá)水平降低、CYP19表達(dá)水平升高（P<0.05）。與正常組比較，模型組大鼠精子數(shù)量較少且形態(tài)異常（P<0.05）；與模型組比較，金匱組和阻滯劑組睪酮（T）、雌二醇（E2）、精子密度和活率升高（P<0.05）；金匱組和阻滯劑組各項(xiàng)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 金匱腎氣丸可改善腎陽(yáng)虛模型大鼠精子質(zhì)量和性激素水平，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制睪丸TGF-β1受體表達(dá)、促進(jìn)CYP19表達(dá)進(jìn)而影響精子發(fā)育與增殖。

關(guān)鍵詞：金匱腎氣丸；精子；細(xì)胞色素P-19；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.020

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）09-0072-04

Effects of Jingui Shenqi Pills on Expressions of Testicular TGF-β1 and CYP19 in Kidney-yang-deficiency Rats ZHANG Xiao-hong1， DONG Hai-jun2， WU Lei-tao2， ZHAO Jiao2， CHEN Yan-qiu2， YANG Qian-qian2， MA Jing2 （1.The Second People's Hospital of Jiuquan City， Jiuquan 735000， China；2.Xijing Hospital， Forth Military Medical University of PLA， Xian 710032， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Jingui Shenqi Pills on the expressions of TGF-β1， CYP19， sex hormone level and sperm quality；To discuss its mechanism for the treatment of male sterility. Methods Forty adult male SD rats were randomly divided into normal group， model group， retardant group and Jingui Shenqi Pills group， 10 rats in each group. Except for the normal group， adenine was used to induce healthy rats to kidney yang deficiency and sterility model rats. Normal group was given normal saline for gavage；retardant group was injected with testicular mesenchyme TGF-β1；Jingui Shenqi Pills group was given Jingui Shenqi Decoction for gavage. Blood was taken through caudal vein. Immunohistochemical， radioimmunoassay and electron microscopy observation were used to detect the expressions of TGF-β1， CYP19， sex hormone level， sperm density and motility rate and testicular morphological changes. Results Compared with normal group， the expression of TGF-β1 in the model group increased and CYP19 decreased （P<0.05）. Compared with model group， the expression of TGF-β1 decreased and the expression of CYP19 increased （P<0.05）. Compared with normal group， the number of sperm quantity was small and paramorphia in model group （P<0.05）. Compared with model group， T， E2， sperm density and motility rate increased significantly in Jingui Shenqi Pills group and retardant group

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30873206）；陜西省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)課題（13-JC049）

通訊作者：馬靜，E-mail：jingma@fmmu.edu.cn

（P<0.05）. There was no statistical significance among indexes in retardant group and Jingui Shenqi Pills group. Conclusion Jingui Shenqi Pills can improve sperm quality and sex hormone level of model rats with kidney-yang-deficiency， which mechanism is probably realized by inhibiting the expression of TGF-β1R and promoting the expression of CYP19 in testis to effect development and proliferation of sperm.

Key words：Jingui Shenqi Pills；sperm；CYP19；TGF-β1；rats

近年來(lái)，男性不育的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，并已成為影響人類發(fā)展和健康的全球性的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。尋找更有效的藥物和方法進(jìn)行治療，已成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里的熱點(diǎn)問(wèn)題。現(xiàn)代研究表明，金匱腎氣丸可通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸的功能，治療男性少精、弱精[1-3]。前期研究顯示，睪丸抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）和細(xì)胞色素P-19（CYP19）的表達(dá)與精子發(fā)生有密切關(guān)系[4-5]，因此，本研究選用金匱腎氣丸干預(yù)雄性腎陽(yáng)虛不育大鼠模型，觀察抑制TGF-β1受體（TGF-β1R）后，大鼠睪丸CYP19和TGF-β1的表達(dá)與精子數(shù)量和質(zhì)量的關(guān)系，以期進(jìn)一步探討金匱腎氣丸治療男性不育的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

選取5月齡雄性SD大鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（260±10）g，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（軍）2013-007。普通飼料，定時(shí)定量喂食，自由飲水，光照12 h、黑夜12 h交替喂養(yǎng)。

1.2 藥物及制備

金匱腎氣丸組方按《金匱要略》記載（干地黃24 g，山藥12 g，山萸肉12 g，澤瀉9 g，牡丹皮9 g，肉桂3 g，附子3 g），飲片均由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科中藥房提供，將藥材煎煮濃縮至含原藥材1.35 g/mL， 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；SB431542準(zhǔn)備：取1 mg SB431542，溶于2.6 μmol DMSO中。將含有SB431542的DMSO用1000 μmo1 PBS液稀釋。

1.3 主要試劑與儀器

TGF-β1R阻滯劑SB431542、兔抗大鼠CYP19單克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體及臺(tái)盼蘭染色劑，美國(guó)Santa公司；羊抗兔試劑盒，武漢博士德生物技術(shù)公司；腺嘌呤，美國(guó)Sigma公司；性激素放射免疫分析試劑盒，北京中杉生物技術(shù)公司。體視解剖鏡（Nikon，SMZ1000），全自動(dòng)精子分析儀SQAV（上海圣荷西醫(yī)療用品有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組與給藥

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常組、模型組、金匱組、阻滯劑組，每組10只。參考文獻(xiàn)[6]方法，將腺嘌呤制成2 mL蒸餾水混懸液，造模大鼠連續(xù)灌胃150 mg/（kg·d），正常組灌服等量生理鹽水，給藥體積2 mL/d，連續(xù)30 d。各組大鼠均普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食。成模后，金匱組給予大鼠金匱腎氣丸水煎劑13.5 g/（kg·d）灌胃，連續(xù)30 d[4]。尾部靜脈采血，脫頸處死，立即摘取睪丸組織并置于Bouin氏液中固定24 h，經(jīng)70%、80%、90%、95%及100%梯度酒精逐級(jí)脫水后，進(jìn)行石蠟包埋、切片以備相應(yīng)檢測(cè)。阻滯劑組按試劑說(shuō)明書給予大鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)注射TGF-β1R阻滯劑SB431542，50 μmol/只。其他組灌服等量生理鹽水，連續(xù)30 d。

2.2 一般觀察

定期測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量。

2.3 血清性激素水平測(cè)定

將采集的血液離心，取血清，參照試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)血清睪酮（T）、雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）和黃體生成素（LH）的水平。

2.4 精子密度和活率測(cè)定

采集精液，37 ℃水浴中孵育10 min，充分液化，置于全自動(dòng)精子分析儀進(jìn)行精子密度和活率測(cè)定。

2.5 細(xì)胞色素P-19、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)測(cè)定

采用免疫組化染色，將睪丸組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟3次，每次10 min；置于100%、95%、90%、80%、70%梯度酒精各10 min；抗原修復(fù)20 min；PBS液洗5 min×3次，甲醇-H2O2室溫孵育30 min，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS液洗5 min×3次，血清封閉，分別滴加1∶400兔抗大鼠TGF-β1及兔抗大鼠CYP19，4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS液洗5 min×5次，滴加羊抗兔二抗于37 ℃恒溫箱孵育30 min，PBS液洗5 min×3次，滴加SABC，37 ℃恒溫箱孵育30 min；PBS液洗5 min×5次，DAB顯色；PBS液終止顯色，蘇木精胞核復(fù)染、封片，光鏡下檢測(cè)TGF-β1及CYP19的表達(dá)。

2.6 睪丸超微結(jié)構(gòu)觀察

將睪丸組織切成2 mm×2 mm的小條，經(jīng)初固定、后固定（pH 7.3～7.4），梯度酒精逐級(jí)脫水、Epon812包埋、固化、超薄切片機(jī)切片50～60 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察睪丸超微結(jié)構(gòu)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)及方差分析，TGF-β1及CYP19表達(dá)均采用Kaplan-Meier法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。