消痰散結(jié)方對MKN—45人胃癌裸鼠原位移植瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

葉敏等

摘要：目的 觀察消痰散結(jié)方對MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，探討其治療胃癌的作用機(jī)制。方法 采用MKN-45人胃癌細(xì)胞株建立裸鼠皮下瘤模型皮下傳3代作為實(shí)驗?zāi)Ｐ偷牧鲈?，采?B膠黏合法建立人胃癌裸鼠原位移植瘤模型。40只模型裸鼠分為空白對照組、模型組、消痰散結(jié)方組、替加氟組，每組10只。消痰散結(jié)方組給予消痰散結(jié)方灌胃，替加氟組給予替加氟灌胃，模型組給予生理鹽水灌胃，空白對照組正常飲食喂養(yǎng)。干預(yù)6周后，測瘤質(zhì)量，計算抑瘤率。透射電鏡觀察藥物作用后移植瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 消痰散結(jié)方組瘤質(zhì)量明顯低于空白對照組及模型組（P<0.05，P<0.01），其抑瘤率為46.2%；電鏡觀察可見胃癌細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)論 消痰散結(jié)方具有誘導(dǎo)MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤細(xì)胞凋亡的作用，提示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是消痰散結(jié)方治療胃癌的可能作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：消痰散結(jié)方；胃癌；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.017

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0060-03

Effects of Xiaotan Sanjie Decoction on Ultramicrostructure in MKN-45 Human Gastric Cancer Orthotopic Xenograft YE Min， SUN Da-zhi， XIU Li-juan， LU Ye， Instructor：WEI Pin-kang （Department of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Changzheng Hospital， Second Military Medical University of PLA， Shanghai 200003， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Xiaotan Sanjie Decoction on ultramicrostructure in MKN-45 human gastric cancer orthotopic xenograft；To discuss its mechanism for gastric cancer. Methods MKN-45 human gastric cancer cell line was used to establish subcutaneous tumor model in nude mice as an experimental model which passed three generations of tumor source. Then OB glue was used to establish human gastric cancer orthotopic xenograft model. 40 model nude mice were divided into control group， model group （received gavage with saline）， Xiaotan Sanjie Decoction group （received garage with Xiaotan Sanjie Decoction） and Tegafur group （received gavage with Tegafur）， 10 mice in each group. Mice in the control group were under normal diet， without medicine intervention. After 6 weeks of treatment intervention， tumor weight was detected， inhibitory rate was calculated， the ultrastructural changes of gastric cancer cells were detected through transmission electron microscopy. Results The tumor weight in Xiaotan Sanjie Decoction group was significantly lower than that in control group and model group （P<0.05，P<0.01）. The tumor inhibition rate was 46.2%. Under the electron microscope， MKN-45 gastric cancer cells strain changed to typical apoptosis. Conclusion Xiaotan Sanjie Decoction can lead to apoptosis effects on MKN-45 human gastric cancer orthotopic xenografts. All evidences indicate that inducing apoptosis may be one of the most important mechanisms of Xiaotan Sanjie Decoction in treating gastric cancer.

Key words：Xiaotan Sanjie Decoction；gastric cancer；cell ultrastructure；mice

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（81273910）

通訊作者：孫大志，E-mail：sunda-zhi@163.com

消痰散結(jié)方為我科魏品康教授臨證40余年經(jīng)驗方，臨床治療胃癌療效較好[1]。前期實(shí)驗研究顯示，消痰散結(jié)方可抑制MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定、在體外對結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用[2-3]。本實(shí)驗選取MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤腫瘤細(xì)胞，通過透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步明確消痰散結(jié)方對胃癌干預(yù)的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性裸鼠40只，7周齡，體質(zhì)量18～20 g，上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司，許可證號SYXK（滬） 2012-0002。實(shí)驗動物飼養(yǎng)于中國科學(xué)院上海實(shí)驗動物中心動物房的空氣層流架內(nèi)，飼養(yǎng)條件為SPF級。

1.2 細(xì)胞株

MKN-45人胃癌細(xì)胞株，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

1.3 藥物

消痰散結(jié)方由法半夏、制天南星、全蝎、蜈蚣、茯苓、雞內(nèi)金、炙甘草等藥物組成，飲片購自上海雷允上公司，消痰散結(jié)方原液（含原藥材約3.35 g/mL）由本院藥材科制劑中心制備；替加氟片，齊魯制藥有限公司，批號206003LD，將其研磨成粉末，溶于生理鹽水，濃度為7.8 mg/mL。

1.4 主要試劑與儀器

多聚甲醛，美國Sigma公司；鋨酸，美國TED PELLA公司。H-7650型透射電鏡，日立（中國）有限公司；UC6型超薄切片機(jī)，德國Leica儀器有限公司。

1.5 造模

1.5.1 裸鼠皮下瘤模型建立 0.2 mL MKN-45人胃癌細(xì)胞懸液接種于1只裸鼠右側(cè)近腋部皮下，當(dāng)皮下移植瘤直徑長至約1 cm時剝?nèi)∫浦擦?，切? mm3瘤塊，再經(jīng)套管針轉(zhuǎn)種至另1只裸鼠腋部皮下，如此反復(fù)進(jìn)行鼠間傳代，以第3代皮下移植瘤為實(shí)驗?zāi)Ｐ偷牧鲈碵4]。

1.5.2 人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的建立 從裸鼠腋下剝?nèi)∧[瘤組織，剪成1 mm3瘤塊備用。實(shí)驗裸鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛0.03 mL/10 g麻醉，常規(guī)手術(shù)，在胃大彎近胃竇處用1 mL無菌空針頭劃破胃壁漿膜層，用無齒鑷將破損處向內(nèi)推壓，使局部胃壁形成凹龕，植入一塊瘤組織于凹龕內(nèi)，并在瘤塊表面滴OB膠1滴，40 s凝固后將胃壁回納入腹腔，0號絲線縫合腹膜及皮膚，關(guān)腹，復(fù)蘇。40只荷瘤鼠均復(fù)制成功并存活。造模成功后48 h開始給藥干預(yù)6周。

1.6 分組及給藥

選擇MKN-45人胃癌原位移植瘤裸鼠40只，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、消痰散結(jié)方組、替加氟組，每組10只。替加氟組予替加氟溶液灌胃，消痰散結(jié)方組予消痰散結(jié)方灌胃，均相當(dāng)于臨床人服用劑量10倍，模型組予等量生理鹽水灌胃，灌胃體積0.4 mL/d。空白對照組正常飲食喂養(yǎng)。連續(xù)6周。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 瘤重及抑瘤率 各組灌胃結(jié)束麻醉脫頸處死裸鼠，分離腫瘤，稱取瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（各組平均瘤質(zhì)量-模型組平均瘤質(zhì)量）÷模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.7.2 移植瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 把少量預(yù)冷的4%多聚甲醛滴在卡片紙上。用刀片取下一小片瘤組織，用滴管吸取等滲0.9%氯化鈉溶液，把血液和組織液沖掉，立即放入卡片紙上的4%多聚甲醛小滴中，然后用新的干凈雙面刀片把瘤組織切成1 mm?小塊，放入裝有4%多聚甲醛的小管中浸泡固定。小管置于4 ℃冰箱中保存。脫水、浸透、包埋、聚合、超薄切片、染色，透射電鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以—x±s表示。采用Levene檢驗進(jìn)行方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)資料均方差齊，采用完全隨機(jī)的方差分析，多個均數(shù)的比較用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 消痰散結(jié)方對瘤重及抑瘤率的影響

稱取瘤重，經(jīng)方差分析，所有實(shí)驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00）。進(jìn)一步兩兩比較，空白對照組與模型組、消痰散結(jié)方組與替加氟組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；消痰散結(jié)方組、替加氟組分別與空白對照組、模型組比較，瘤質(zhì)量明顯降低（P<0.05，P<0.05）；消痰散結(jié)方組抑瘤率為46.2%，替加氟組抑瘤率為47.3%。結(jié)果見表1。

2.2 透射電鏡觀察結(jié)果

空白對照組及模型組腫瘤細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)基本正常；消痰散結(jié)方組腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜不連貫，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，染色體異染色質(zhì)聚集，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，嵴結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞呈凋亡狀態(tài)；替加氟組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)巨大空泡，細(xì)胞核固縮，線粒體結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，呈凋亡狀態(tài)。結(jié)果見圖1。

3 討論

胃癌屬中醫(yī)“噎膈”“反胃”“積聚”等病證范疇。魏品康教授總結(jié)臨證40余年經(jīng)驗，認(rèn)為胃癌發(fā)病機(jī)制為六淫入侵、飲食失宜及七情內(nèi)傷，導(dǎo)致氣機(jī)阻滯，津液停滯，痰濁內(nèi)蘊(yùn)，浸淫細(xì)胞，細(xì)胞突變，進(jìn)而結(jié)聚為腫瘤。基于對胃癌病因病機(jī)“痰本質(zhì)”的認(rèn)識，魏品康教授提出胃癌治療的“消痰散結(jié)”法。

消痰散結(jié)方由二陳湯合導(dǎo)痰湯化裁而來，方以法半夏、制南星辛溫苦燥、善消痰燥濕共為君，天龍、全蝎等解毒散結(jié)通絡(luò)共為臣，陳皮理氣和胃、雞內(nèi)金助胃之消導(dǎo)而為佐，炙甘草溫中健脾、調(diào)和諸藥為使。本方在消痰藥物中輔以理氣散結(jié)之品，使頑痰得以消散，病因得以根除。

本實(shí)驗選用替加氟作為陽性藥物，替加氟是氟尿嘧啶的衍生物，先在體內(nèi)經(jīng)肝臟活化逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜞奏?，再轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜞奏ず塑蘸兔撗醴蜞奏ず塑眨缓蟛虐l(fā)揮其強(qiáng)有力的對胸腺嘧啶核苷酸合成酶的抑制作用，從而發(fā)揮其抗腫瘤活性，在體內(nèi)干擾、阻斷DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成，是一種抗嘧啶類藥物。目前臨床以5-氟尿嘧啶（5-Fu）為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療作為一線治療方案，及以替加氟為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案，均被證實(shí)對胃癌的臨床療效明確[5-6]。并且體外實(shí)驗研究顯示，MKN-45胃癌細(xì)胞對5-Fu高度敏感[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，消痰散結(jié)方對MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤有明顯的抑制作用，消痰散結(jié)方組瘤質(zhì)量明顯低于空白對照組及模型組（P<0.05），其抑瘤率為46.2%，抑制作用類似于替加氟組。通過進(jìn)一步透射電鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，消痰散結(jié)方組及替加氟組腫瘤細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡狀態(tài)，細(xì)胞膜不連貫，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，染色體異染色質(zhì)聚集，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，嵴結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡。在正常細(xì)胞代謝活動中，細(xì)胞凋亡和增殖處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞凋亡程序受到抑制就有可能產(chǎn)生腫瘤。研究結(jié)果表明，消痰散結(jié)方能影響胃癌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，可誘導(dǎo)其凋亡從而達(dá)到抑制胃癌的作用，為消痰散結(jié)方干預(yù)胃癌的作用機(jī)制提供了細(xì)胞生物學(xué)水平的驗證。

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（收稿日期：2015-01-12；編輯：華強(qiáng)）