復(fù)合型腎虛質(zhì)大鼠神經(jīng)行為障礙與NMDA受體表達(dá)研究

孫瑜嬬等

摘要：目的 探討腎虛質(zhì)與腦功能衰退的相關(guān)性及腎藏志理論的物質(zhì)基礎(chǔ)與神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。方法 采用“貓嚇鼠”造模法造成先天不足加后天失養(yǎng)復(fù)合型腎虛模型，隨機(jī)分為模型組、左歸丸組和右歸丸組；空白組產(chǎn)自正常孕鼠。對仔鼠恐嚇同時(shí)開始灌胃，左歸丸組、右歸丸組分別給予左歸丸、右歸丸混懸液，空白組和模型組給予等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)2個(gè)月。懸吊試驗(yàn)和Y迷宮實(shí)驗(yàn)觀測大鼠運(yùn)動(dòng)和空間學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化法檢測N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體亞基NR2A、NR2B蛋白表達(dá)。結(jié)果 懸吊試驗(yàn)：模型組持續(xù)時(shí)間低于空白組（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組高于模型組（P<0.05）；Y迷宮實(shí)驗(yàn)：模型組跑至安全區(qū)正確次數(shù)低于空白組（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組高于模型組（P<0.05）；模型組NR2A、NR2B光密度值較空白組降低（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組光密度值較模型組升高（P<0.05）。結(jié)論 腎虛質(zhì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)異常且海馬NMDA受體亞基表達(dá)降低；左歸丸、右歸丸可上調(diào)NMDA受體表達(dá)且改善大鼠腦功能，揭示了腎虛質(zhì)與腦功能衰退的相關(guān)性及腎藏志理論的物質(zhì)基礎(chǔ)與神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。

關(guān)鍵詞：腎虛質(zhì)；懸吊試驗(yàn)；Y迷宮實(shí)驗(yàn)；NR2A蛋白；NR2B蛋白；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.015

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）09-0052-04

Study on Neurobehavioral Disorders and NMDA Receptor Expression in Rats with Kidney-deficiency Constitution SUN Yu-ru， SUN Yao-guang， ZHANG Qi， WANG Xiao-di， WANG Xing， SUN Li-jun （Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China）

Abstract：Objective To discuss the correlation between kidney-deficiency constitution and brain function decline， and material basis of kidney-storing-spirit theory and neurobiology mechanism. Methods By employing the method of “cats scare rats”， composite offspring rat models with deficiency and acquired dystrophy were built， then they were divided into model group， Zuogui Pill group and Yougui Pill group. Blank group was composed from normal pregnant rats. When the intimidation of offspring began， Zuogui Pill and Yougui Pill groups received gavage with corresponding doses of medicine， 1 times per day for 2 consecutive months. Model and blank groups received the same amount of normal saline. Exercise capacity was detected by suspension test. Learning and memory capacity was detected by Y maze test. Expressions of NMDA receptor subunits NR2A and NR2B were detected by immunohistochemical method. Results In suspension test， the duration of model group was shorter than blank group （P<0.05）， while duration of Zuogui Pill and Yougui Pill groups was longer than the model group （P<0.05）. In Y maze test， the correct number of model group was less than blank group， and increased significantly after treatment （P<0.05）. The optical density of NR2A and NR2B was lower in model group than blank group （P<0.05） and higher in Zuogui Pill and Yougui Pill groups than model group （P<0.05）. Conclusion The neurobehavioral is abnormal and NMDA receptor expression depresses in rats with kidney- deficiency constitution. Zuogui Pill and Yougui Pill can rise NMDA receptor expression and improve brain function of rats， which reveal the correlation between kidney-deficiency constitution and brain function decline， and material basis of kidney-storing-spirit theory and neurobiology mechanism.

Key words：kidney-deficiency constitution；suspension test；Y maze test；NR2A；NR2B；rats

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳研究項(xiàng)目（2013JM4033）；陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究項(xiàng)目（13JS031）

《靈樞·本神》曰：“恐懼而不解則傷精，精傷者則骨酸痿厥，精時(shí)自下?！蓖醣⑨專骸翱侄灰褎t內(nèi)感于腎，故傷也?！敝嗅t(yī)理論認(rèn)為，腎為先天之本，藏有先天之精和后天之精，腎精的盛衰決定著子代稟賦的強(qiáng)弱。腎藏精生髓，腦為髓海，主神志思維，司機(jī)體運(yùn)動(dòng)。髓由腎精及氣血所化，充養(yǎng)腦實(shí)質(zhì)，腎虛則經(jīng)不上承而腦髓空虛、腦竅失養(yǎng)致腦失其用[1]。本實(shí)驗(yàn)以腎虛質(zhì)大鼠運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)等神經(jīng)行為學(xué)改變和海馬N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體亞基NR2A、NR2B蛋白表達(dá)為切入點(diǎn)，探討腎虛質(zhì)和腦功能衰退的相關(guān)性，以及腎藏志理論的物質(zhì)基礎(chǔ)和神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

8周齡清潔級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量200～300 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（陜）2007-001。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂食，不限飲水，室溫。雌雄土貓各1只，3月齡，兇狠善叫，鮮活大鼠喂食，不限飲水，室溫。

1.2 主要藥物、試劑與及儀器

左歸丸（批號(hào)100306）、右歸丸（批號(hào)110309），河南省宛西制藥股份有限公司。DAB顯色試劑盒、SABC試劑盒、枸櫞酸緩沖液、水合氯醛、乙醇、多聚甲醛、30%蔗糖溶液、OCT包埋劑、30%H2O2、NR2A、NR2B一抗、二抗（武漢博士德生物技術(shù)公司）。Y迷宮（上海軟隆科技發(fā)展有限公司），電子天平、冰凍切片機(jī)、顯微鏡等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模

參照本課題組前期研究方法[2]，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按雄性∶雌性=1∶2比例合籠交配。成功受孕后將孕母鼠隨機(jī)分為對照組和腎虛組，每組10只。腎虛組孕鼠置于特制鼠籠，于8：00-19：00置于貓籠旁進(jìn)行恐嚇，同時(shí)在貓籠內(nèi)放置雄鼠令其捕食使孕鼠在旁處于恐慌狀態(tài)。對照組孕鼠不作刺激處理。非恐嚇時(shí)間2組均置于同處并確保其他非處理因素一致，至2組孕鼠產(chǎn)子，將仔鼠飼養(yǎng)4周后進(jìn)行分組?？瞻捉M從對照組孕鼠所產(chǎn)仔鼠中隨機(jī)選取10只；腎虛組孕鼠所產(chǎn)仔鼠隨機(jī)選取30只，分為模型組、左歸丸組和右歸丸組各10只，繼續(xù)對此3組仔鼠實(shí)施上述“貓嚇鼠”方案，持續(xù)個(gè)1月。空白組仔鼠零刺激，非恐嚇時(shí)間4組仔鼠均置于同處減小非處理因素。

2.2 給藥

大鼠用藥量約為成人的6.25倍[3]。左歸丸每10丸含原藥材1 g，成人每日服18 g，則大鼠每日服1.875 g/kg，蒸餾水配成1.875 g/mL混懸液備用。右歸丸每8丸含原藥材3 g，成人每日服9 g，則大鼠每日服0.937 5 g/kg，蒸餾水配成0.937 5 g/mL混懸液備用。對仔鼠恐嚇同時(shí)開始給藥，藥物組分別予上述混懸液灌胃，空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃，給藥體積10 mL/kg，每日1次，每周用藥5 d，停2 d， 連續(xù)2個(gè)月。

2.3 神經(jīng)行為學(xué)檢測

2.3.1 懸吊試驗(yàn) 各組仔鼠8周齡時(shí)進(jìn)行懸吊試驗(yàn)，使仔鼠前爪抓住距桌面50 cm高水平放置的玻璃棒（棒長約40 cm，直徑0.6 cm），記錄仔鼠掉至桌面的時(shí)間，計(jì)分評(píng)判仔鼠運(yùn)動(dòng)能力。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：<10 s計(jì)1分，10～30 s計(jì)2分，>30～120 s計(jì)3分，>2～5 min計(jì)4分，>5 min計(jì)5分。每只仔鼠懸吊3次，每次休息10 min，取3次平均值。

2.3.2 Y迷宮實(shí)驗(yàn) 各組仔鼠10周齡時(shí)進(jìn)行Y迷宮實(shí)驗(yàn)，Y迷宮三條臂盡頭均有一盞15 W燈泡，底部為電網(wǎng)，電壓50～70 V。實(shí)驗(yàn)時(shí)一條臂燈亮，底部電網(wǎng)不通電為安全區(qū)；另兩側(cè)燈不亮，延時(shí)5 s后底部通電為非安全區(qū)，刺激仔鼠使其跑向安全區(qū)。仔鼠到達(dá)安全區(qū)30 s后隨機(jī)更換安全區(qū)位置，10 s內(nèi)順利從非安全區(qū)一次性跑到安全區(qū)則判為正確。每只仔鼠實(shí)驗(yàn)后75%酒精擦洗Y臂以排除氣味干擾。實(shí)驗(yàn)第1日為適應(yīng)階段，每只仔鼠在Y迷宮中自由活動(dòng)5 min；第2～4日為學(xué)習(xí)訓(xùn)練階段，每只仔鼠從同一臂即起始臂放入Y迷宮，30次/d，持續(xù)訓(xùn)練3 d；第5日為測試階段，記錄30次測試中仔鼠正確進(jìn)入安全區(qū)的次數(shù)。

2.4 NR2A、NR2B蛋白表達(dá)檢測

2.4.1 組織提取及切片 各組仔鼠用藥2個(gè)月、禁食12 h后稱重，7%水合氯醛0.05 mL/kg腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注，取海馬4%多聚甲醛4 ℃固定4～6 h，PBS沖洗5 min×3次，置30%蔗糖4 ℃過夜，PBS洗5 min×3次、干燥、OCT包埋，冰凍切片，室溫靜置1 h待測。

2.4.2 免疫組化法檢測 切片置于甲醇新鮮配制的0.3%雙氧水，室溫封閉20 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5 min×3次，置于0.01 mol/L pH 6.0枸櫞酸緩沖液95 ℃，煮沸15 min，冷卻后PBS洗5 min×3次，5%BSA 37 ℃封閉20 min，棄多余液體；滴加稀釋后一抗，4 ℃過夜，取出復(fù)溫，PBS洗5 min×3次，滴加二抗， 37 ℃溫浴30 min，PBS洗5 min×3次，，滴加新鮮配制的DAB顯色液避光顯色，鏡下控制顯色程度，雙蒸水洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，37 ℃干燥過夜，光鏡下觀察拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，對陽性細(xì)胞測定平均吸光度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 神經(jīng)行為學(xué)檢測結(jié)果

4.1.1 懸吊試驗(yàn) 模型組懸吊持續(xù)時(shí)間明顯低于空白組（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組持續(xù)時(shí)間明顯高于模型組（P<0.05），見表1。

4.1.2 Y迷宮實(shí)驗(yàn) 模型組進(jìn)入安全正確次數(shù)明顯低于空白組（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組正確次數(shù)明顯高于模型組（P<0.05），見表2。

4.2 補(bǔ)腎中藥對NR2A、NR2B蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組NR2A、NR2B平均吸光度值明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，左歸丸組和右歸丸組平均吸光度值明顯升高（P<0.05）。鏡下觀察顯示，空白組神經(jīng)細(xì)胞較多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密且層次清楚；模型組腦組織存在散在的片狀水腫，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散；左歸丸組和右歸丸組大腦皮質(zhì)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密且層次清楚，無明顯水腫區(qū)。結(jié)果見表3、圖1、圖2。

5 討論

腎虛質(zhì)是各類人群中常見的體質(zhì)類型之一，是一種以腎中精氣虧虛、腎臟功能低下為主要特征的體質(zhì)狀態(tài)[4]。中醫(yī)情志學(xué)說有“腎藏志，在志為恐”，一方面，“腦為元神之府”，是“腎藏志”理論中“志”產(chǎn)生活動(dòng)的中樞部位；另一方面，“腦為髓之?！保I虛則髓不實(shí)，腎虛以“髓”為中介反作用于腦，直接影響機(jī)體運(yùn)動(dòng)與思維。

臨床研究表明，腎虛質(zhì)多包含腦神經(jīng)行為方面的障礙[5-7]。懸吊試驗(yàn)是隨意運(yùn)動(dòng)檢測，主要反映肌力、軀體平衡力及上肢運(yùn)動(dòng)力。實(shí)驗(yàn)中模型組仔鼠運(yùn)動(dòng)力低于空白組，通過補(bǔ)腎藥物治療后結(jié)果逆轉(zhuǎn)。Y迷宮實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于動(dòng)物的辨別性學(xué)習(xí)、工作記憶及參考記憶的測試，因其受實(shí)驗(yàn)環(huán)境、溫度和操作等影響較小而廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)和記憶研究領(lǐng)域[8]。Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組較空白組正確次數(shù)降低，表明腎虛對運(yùn)動(dòng)功能和

空間學(xué)習(xí)記憶力的抑制作用及補(bǔ)腎藥物的治療作用。

研究表明，NMDA受體與突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育的可塑性、缺血缺氧損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的疼痛傳導(dǎo)、術(shù)后認(rèn)知功能障礙及老年性癡呆等神經(jīng)退行性疾病等都有密切關(guān)系[9]。NR2A與NR2B是NMDA受體的2個(gè)重要亞基，在皮層特征性發(fā)育轉(zhuǎn)變中具有重要作用，且主要與學(xué)習(xí)記憶的獲得關(guān)系密切[10-11]。所以，本實(shí)驗(yàn)選取NR2A、NR2B的表達(dá)為切入點(diǎn)，從神經(jīng)生物學(xué)角度揭示腎虛質(zhì)對腦學(xué)習(xí)記憶能力的抑制性影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎虛質(zhì)組NR2A與NR2B的低表達(dá)及補(bǔ)腎藥物干預(yù)后的表達(dá)回升均反映出與前期研究結(jié)果一致，即腎虛質(zhì)抑制性影響腦功能。

腎虛體質(zhì)主要表現(xiàn)為腎精虧虛，腎藏精是腎的最基本功能，腎精所產(chǎn)生的生理效應(yīng)有腎陰、腎陽兩大方面，故實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了補(bǔ)腎陰的左歸丸組和補(bǔ)腎陽的右歸丸進(jìn)行觀察。作為補(bǔ)腎中藥的代表方，左歸丸、右歸丸可影響老年大鼠大腦邊緣系統(tǒng)（海馬、杏仁核）對下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺（HPAT）軸的調(diào)控作用，可糾正老年大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌功能的異常變化[12]，并且可以通過提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體TrkB的基因表達(dá)改善老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予左歸丸、右歸丸治療后，仔鼠運(yùn)動(dòng)能力、空間學(xué)習(xí)記憶能力及NMDA受體亞基表達(dá)均有所提高，說明本研究所建立的腎虛體質(zhì)動(dòng)物模型主要表現(xiàn)為腎精虛，精虛不能舍志從而導(dǎo)致大腦功能減退。提示補(bǔ)腎中藥可用來治療有腎虛質(zhì)特征的腦功能障礙，同時(shí)提示NMDA受體是腎藏志理論中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，揭示了腎藏志理論的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。

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（收稿日期：2015-01-05）

（修回日期：2015-01-28；編輯：華強(qiáng)）