蟲草發(fā)酵菌粉的活性成分分析

許春燕 李恒 陸震鳴

摘要 [目的]比較蟲草頭孢和蝙蝠蛾被孢霉2種發(fā)酵菌粉中活性組分的差異，為蟲草發(fā)酵菌種的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。[方法]采用重量法測定多糖含量，采用離子色譜法檢測粗多糖的單糖組成，采用高效液相色譜法測定核苷類物質(zhì)含量，采用FolinCiocalteu法測定總多酚含量，采用香草醛-高氯酸法測定總?cè)坪?。[結(jié)果]2種菌粉中粗多糖含量在7%左右，均由6種單糖構(gòu)成；發(fā)酵菌粉中均檢測到含量較高的胞苷、鳥苷和腺苷等核苷類化合物；2種蟲草發(fā)酵菌粉中總多酚的含量約5 mg/g，三萜物質(zhì)含量約8 mg/g。[結(jié)論]蟲草頭孢和蝙蝠蛾被孢霉2種發(fā)酵菌粉在多糖、核苷、多酚和三萜類物質(zhì)的含量上無顯著差異，均具有較高的藥用活性和良好的開發(fā)前景。

關(guān)鍵詞 蟲草；蟲草頭孢；蝙蝠蛾被孢霉；發(fā)酵菌粉；活性成分

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）34-168-02

冬蟲夏草（Chinese cordyceps）在分類學(xué)上屬于子囊菌亞門、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，是一種傳統(tǒng)的中草藥和保健品[1]。蟲草中含有多種活性成分，如蟲草多糖、核苷、甾醇等[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)了蟲草具有清除自由基[3]、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫[4]、降低血糖[5]、抗感染[6]等多種藥理活性。蟲草的多種療效與其內(nèi)在化學(xué)成分的種類與含量是密切相關(guān)的[2]。

近年來，蟲草因其特有的生理藥理活性已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。然而，野生冬蟲夏草資源稀少，僅分布于青藏高原及海拔3 000 m以上、雪線以下的地區(qū)。隨人工開發(fā)力度的增大，野生冬蟲夏草資源逐漸趨于匱乏，而蟲草的人工栽培較為困難，這些現(xiàn)實(shí)問題促使了蟲草發(fā)酵技術(shù)的產(chǎn)生以及規(guī)?；a(chǎn)的快速發(fā)展。目前，蟲草發(fā)酵已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，能夠滿足人民健康的需求。

蟲草發(fā)酵研究的關(guān)鍵問題之一是菌種。目前已從野生冬蟲夏草中分離得到了眾多冬蟲夏草菌，其中，用于蟲草發(fā)酵研究與開發(fā)的菌種主要有中國被毛孢（Hirsutella sinensis X.J.Liu，Y.L.Guo，Y.X.Yu & W.Zeng）、蟲草頭孢（Cephalosporium sinensis Chen）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepialid C.T.Chen & B.Liu）等[7-8]。利用相關(guān)菌種已研發(fā)出相應(yīng)的一系列保健品，并形成了一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模，有關(guān)蟲草發(fā)酵菌粉的成分研究也已經(jīng)開展。然而，各種發(fā)酵菌粉中的活性成分以及相應(yīng)的藥理活性尚需要進(jìn)一步鑒定與比較。筆者在此對蟲草頭孢和蝙蝠蛾被孢霉2種發(fā)酵菌粉中的多糖、核苷、多酚及三萜類物質(zhì)進(jìn)行了測定，比較這些活性組分在種類及含量上的差異，為蟲草發(fā)酵菌種的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲草菌粉。

蟲草頭孢、蝙蝠蛾被孢霉發(fā)酵菌粉均由國內(nèi)某企業(yè)提供。

1.1.2 試劑。

齊墩果酸、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購于中國食品藥品檢定研究院。其余試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器。

UV2100紫外分光光度計(jì)，上海Unico儀器有限公司；氣相色譜儀（GC2010），日本Shinadzu公司；高效液相色譜儀（HPLC），美國Agilent公司；ICS5000離子色譜儀，美國Dionex公司；高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；真空干燥儀，美國Savant公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲草多糖含量及單糖組成分析。

采用重量法測定蟲草多糖含量。取蟲草菌粉1 g加入20 ml去離子水，90 ℃水浴0.5 h，冷卻后離心收集上清。重復(fù)該過程3次并合并上清。上清液濃縮后，緩慢滴加無水乙醇至乙醇含量達(dá)75%，4 ℃過夜后離心，沉淀干燥至恒重后稱重。

準(zhǔn)確稱取5 mg多糖加入到2 ml 2 mol/L HCl溶液中，95 ℃水浴5 h后加入等體積的2 mol/L NaOH溶液中和，12 000 r/min離心10 min后取上清進(jìn)行離子色譜分析。色譜柱為CarboPac PA20；柱溫45 ℃；流動相為水∶NaOH溶液（250 mmol/L）=98.2∶1.8（V/V），流速0.5 ml/min；脈沖安培檢測器。

1.2.2 核苷類物質(zhì)含量測定。

稱取0.1 g菌粉于EP管中，加入2 ml甲醇-水（1∶1，V/V）溶液，超聲提取 30 min后靜置過夜，12 000 r/min離心后取上清過濾膜供分析。色譜柱為Diamonsil C18（4.6×250 mm）；流動相為甲醇∶去離子水∶磷酸=5∶95∶0.05（V/V/V），流速0.8 ml/min，260 nm紫外檢測；柱溫30 ℃。

1.2.3 總多酚含量測定。

準(zhǔn)確稱取菌粉5.0 g于250 ml三角瓶中，加入50 ml 70%乙醇超聲提取30 min，重復(fù)操作3次并合并濾液，并定容至100 ml。取待測樣品溶液1.0 ml，再分別依次加1.0 ml FolinCiocalteu試劑及1.0 ml 10% Na2CO3溶液，然后用蒸餾水定容至5.0 ml，在室溫下靜置30 min后用0.5 cm光徑比色杯在波長為765 nm的條件下進(jìn)行比色測定，以空白試劑為參比[9]。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行總多酚的定量。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.119 1x+0.053 3（R2= 0.997），其中x為沒食子酸濃度（μg/ml），y為吸光值。

1.2.4 總?cè)坪繙y定。

準(zhǔn)確稱取菌粉0.5 g于2 ml EP管中，加入500 μl甲醇，50 Hz超聲15 min后過夜，取甲醇提取液100 μl于10 ml具塞試管中，水浴蒸干，加0.3 ml新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 ml高氯酸，60 ℃反應(yīng)20 min，冰水冷卻，加入10 ml冰醋酸，搖勻后在550 nm 波長下測定吸光度，根據(jù)齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行總?cè)坪繙y定[10]。齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.010 1x-0.009 5，其中x為齊墩果酸濃度（μg/ml），y為吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草多糖的分析測定

大量醫(yī)學(xué)試驗(yàn)證實(shí)，多糖是冬蟲夏草中的重要活性成分之一，可活化巨噬細(xì)胞刺激抗體產(chǎn)生，提高免疫，抑制炎癥與腫瘤，同時具有修復(fù)細(xì)胞等功能[11-12]。經(jīng)檢測，蟲草頭孢和蝙蝠蛾被孢霉2種蟲草發(fā)酵菌粉中的粗多糖含量相近，分別為6.24%、7.57%。進(jìn)一步分析單糖組成發(fā)現(xiàn)（表1），2種菌粉的單糖相對含量有所差異，但均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6種單糖構(gòu)成，其中，半乳糖、葡萄糖和甘露糖為主要組分，約占多糖含量的70%，這與趙秋蓉等[13]研究得出的蟲草多糖的單糖組成一致。

2.2 核苷類物質(zhì)的分析測定

核苷是蟲草中的有效成分之一，尤以腺苷具有明顯的藥理作用，如改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性等。我國也已將冬蟲夏草腺苷含量的測定寫入藥典[14]。由表2可知，2種蟲草發(fā)酵菌粉中均檢測到了含量較高的胞苷、鳥苷和腺苷，其中，腺苷含量遠(yuǎn)高于冬蟲夏草子實(shí)體（1.93 mg/g）及固體發(fā)酵冬蟲夏草菌絲中的腺苷含量（0.75 mg/g），這與Yang等[15]的研究結(jié)果一致。而與其他發(fā)酵菌粉相比，蟲草頭孢與蝙蝠蛾被孢霉發(fā)酵菌粉中的腺苷含量顯著高于市售蝙蝠蛾擬青霉（金水寶膠囊）、中華束絲孢（百令膠囊）和粉紅膠霉（心肝寶膠囊）發(fā)酵菌粉。蟲草頭孢發(fā)酵菌粉與市售其他蟲草頭孢菌粉（寧心寶膠囊）相比，則可能由于生產(chǎn)工藝不同，使得不同來源的發(fā)酵菌粉中的含量差異較大[16]。蟲草頭孢與蝙蝠蛾被孢霉發(fā)酵菌粉的核苷物質(zhì)含量差異不顯著。肌苷和蟲草素均未檢測到。

表2 蟲草菌粉中核苷類物質(zhì)含量

mg/g

樣品胞苷鳥苷肌苷腺苷蟲草素

蟲草頭孢9.882.06N.D.5.34N.D.

蝙蝠蛾被孢霉8.721.87N.D.5.90N.D.

注：N.D.表示未檢出。

2.3 總多酚的分析測定

多酚類化合物普遍具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等藥理活性[17]。經(jīng)測定，2種蟲草發(fā)酵菌粉中均含有較高含量的多酚類物質(zhì)，蟲草頭孢中的總多酚含量（5.11 mg/g）略高于蝙蝠蛾被孢霉（4.52 mg/g）。與其他來源蟲草相比，多酚含量差異較為顯著，這是由于發(fā)酵菌種的不同以及發(fā)酵條件的差異引起的[18]。

2.4 總?cè)频姆治鰷y定

三萜類化合物被證明具有抗腫瘤、抑制組織胺釋放、抗HIV、抑制膽固醇生物合成與吸收等多種藥理學(xué)活性[19]。經(jīng)檢測，2種蟲草菌粉均含有較高的三萜含量，蝙蝠蛾被孢霉中的含量（8.29 mg/g）略高于蟲草頭孢中的含量（7.73 mg/g）。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)對蟲草頭孢與蝙蝠蛾被孢霉2種蟲草發(fā)酵菌粉中的多糖、核苷、多酚及三萜類物質(zhì)進(jìn)行了測定，比較這些活性組分在種類及含量上的差異。結(jié)果表明，2種菌粉中粗多糖含量在7%左右，均由6種單糖構(gòu)成；2種蟲草發(fā)酵菌粉中均檢測到含量較高的胞苷、鳥苷和腺苷等核苷類化合物，總多酚的含量約5 mg/g，三萜類物質(zhì)含量約8 mg/g。2種菌粉在這些有效成分的含量上并無顯著差異，表明2種菌粉均具有較高的潛在藥用活性和良好的開發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 林群英，李泰輝，宋斌，等.廣東蟲草與冬蟲夏草及蛹蟲草的成分比較 [J].食用菌學(xué)報(bào)，2009，16（4）：54-57.

[2] 王尊生，顧宇翔，周麗，等.冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）菌絲體固體發(fā)酵粉化學(xué)成分的分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（3）：331-336.

[3] 李曉磊，趙珺，李丹，等.冬蟲夏草深層發(fā)酵菌絲體和蛹蟲草子實(shí)體抗氧化活性的對比研究[J].食品科技，2009，34（9）：75-78.

[4] 宋林霞.冬蟲夏草抗腫瘤作用的研究進(jìn)展及展望[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（14）：3387-3388.

[5] ZHANG G，HUANG Y，BIAN Y，et al.Hypoglycemic activity of the fungi Cordyceps militaris，Cordyceps sinensis，Tricholoma mongolicum，and Omphalia lapidescens in streptozotocininduced diabetic rats [J].Appl Microbiol Biotechnol，2006，72（6）：1152-1159.

[6] WON S Y，PARK E H.Antiinflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris[J].J Ethnopharmacol，2005，96（3）：555-561.

[7] 勞景輝，閆文娟，方佳茂，等.冬蟲夏草發(fā)酵技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國食用菌，2012，31（6）：5-7.