篩選具有抑制引起腹瀉致病菌黏附功能的益生菌

薛超輝，張?zhí)m威，張迎春，單毓娟，王淑梅，李洪波（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

篩選具有抑制引起腹瀉致病菌黏附功能的益生菌

薛超輝，張?zhí)m威*，張迎春，單毓娟，王淑梅，李洪波
（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

篩選能夠抑制引起腹瀉致病菌黏附的益生菌，并且對(duì)其適應(yīng)腸道環(huán)境：耐酸、耐膽鹽和黏附性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。從中國(guó)西部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及人類糞便樣品中分離的14株益生菌作為篩選菌株。對(duì)這14株益生菌進(jìn)行抑制致病菌黏附的篩選，最終篩選出7株使致病菌黏附數(shù)量降低到1.5×104CFU/mL的益生菌進(jìn)行耐受腸道環(huán)境能力評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這7株益生菌在pH2的條件下處理90min后存活的益生菌依然能夠達(dá)到107CFU/mL左右，在0.3%的膽鹽環(huán)境中處理2h后菌數(shù)降低到原來(lái)的百分之一，單層細(xì)胞上黏附的益生菌數(shù)J5、G15和F0533能夠達(dá)到106CFU/mL，顯示出了較強(qiáng)的黏附能力。經(jīng)過(guò)綜合分析篩選出F0533、IN4125、G15、J5和M7益生菌，經(jīng)16S rDNA基因技術(shù)鑒定分別為L(zhǎng)actobacillus rhamnosus、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei。

益生菌，沙門(mén)氏菌，抑制粘附，耐酸耐膽鹽

益生菌是指一類活著的微生物，當(dāng)人類使用足夠的量時(shí)就會(huì)在腸道中存活，而且對(duì)人體產(chǎn)生有益的影響。1907年梅切尼科夫提出“喝酸乳可以長(zhǎng)壽不老學(xué)說(shuō)”，19世紀(jì)30年代田稔博士發(fā)現(xiàn)了可以活著到達(dá)小腸的養(yǎng)樂(lè)多菌，并對(duì)其功效進(jìn)行了深入的研究后，顯示了乳酸菌并不僅僅只是用來(lái)發(fā)酵乳品的細(xì)菌，而是有益于腸道菌群平衡、對(duì)于人類健康有幫助的菌種，這種對(duì)人類健康有益的細(xì)菌被稱為益生菌［1-2］。自90年代初以來(lái)，形形色色的“益生菌”類保健品風(fēng)靡了整個(gè)世界。與此同時(shí)，“益生菌”的研究也已成為國(guó)際上的熱門(mén)研究課題。何謂益生菌？益生菌來(lái)源于希臘字母“probios”為生命的意思，益生菌的歷史可以追溯到人類歷史初期，希臘人和古羅馬人已經(jīng)開(kāi)始食用奶酪和發(fā)酵乳制品，特別是給孩子和康復(fù)期的病人食用［3］。

腹瀉是發(fā)展中國(guó)家導(dǎo)致兒童死亡的最主要原因，腹瀉除了直接引起健康問(wèn)題外，還引起人體營(yíng)養(yǎng)失調(diào)，生長(zhǎng)速度減緩等問(wèn)題。隨著近幾年來(lái)診斷技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始研究引起腹瀉的原因，進(jìn)而對(duì)引起腹瀉的機(jī)制更深入的了解［4-5］。引起嬰幼兒腹瀉的主要致病菌包括：大腸埃希氏菌、志賀氏菌、彎曲桿菌、弧菌和沙門(mén)氏菌。輪狀病毒依然是引起嬰兒腹瀉的主要原因，大約占到總腹瀉的20%，然而整個(gè)致病菌依然占主要地位，大腸桿菌（11%）、彎曲桿菌（7%）、志賀氏菌（5%）被認(rèn)為是引起腹瀉最常見(jiàn)的致病菌。所以抑制引起腹瀉的致病菌將能夠有效的抑制腹瀉的發(fā)生，致病菌引起腹瀉的過(guò)程包括黏附、生長(zhǎng)和侵入等過(guò)程，抑制致腹瀉致病菌的益生菌的主要篩選指標(biāo)是抑制致病菌生長(zhǎng)和黏附［6］。

本文將篩選能夠抑制引起腹瀉致病菌的益生菌，篩選能夠抑制致病菌黏附的益生菌菌株。益生菌進(jìn)入腸道定植的過(guò)程中要經(jīng)受胃酸低pH環(huán)境，益生菌活性將會(huì)受到很大損失，在小腸中存在著一定濃度的膽鹽，益生菌活性也會(huì)遭到損失，因此益生菌的耐酸和耐膽鹽能力是其益生功能的重要指標(biāo)。將篩選出的益生菌進(jìn)行耐酸、耐膽鹽實(shí)驗(yàn)以確定益生菌適應(yīng)腸道環(huán)境的性能。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試菌株本實(shí)驗(yàn)室保存共44株（從傳統(tǒng)發(fā)酵乳和人體腸道中分離純化），選取L.GG菌株為參照進(jìn)行篩選，將益生菌分別接種于MRS、M17和TPY液體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h，活化3代；致病菌指標(biāo)菌沙門(mén)氏菌（Salmonella ATCC14028），沙門(mén)氏菌接種于TSB培養(yǎng)基中活化3代；HT-29細(xì)胞

按常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640、100U/mL鏈霉素和100U/mL鏈霉素細(xì)胞培養(yǎng)液中，于CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，95%空氣）中37℃培養(yǎng)，每48h換培養(yǎng)液一次，長(zhǎng)成單層后傳代接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，于5%CO2，95%空氣，37℃恒溫培養(yǎng)，48h后進(jìn)行黏附性實(shí)驗(yàn)。

ABI2720型PCR儀美國(guó)ABI公司；SW-CJ-1D型無(wú)菌操作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-40AI型高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；GL-10LM型離心機(jī)星科離心機(jī)有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1篩選具有抑制致病菌黏附功能的益生菌根據(jù)Kamini等提供的方法測(cè)定益生菌抑制致病菌黏附的能力［8］。將分離出的益生菌菌株在MRS培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)24h，致病菌在其培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。HT-29細(xì)胞按常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640、100U/mL鏈霉素和100U/mL鏈霉素細(xì)胞培養(yǎng)液中，于CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，95%空氣）中37℃培養(yǎng)，每48h換培養(yǎng)液一次，長(zhǎng)成單層后傳代接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中后進(jìn)行黏附性實(shí)驗(yàn)。

將長(zhǎng)成單層24孔組織細(xì)胞培養(yǎng)板（約1×105CFU/ mL）中加入200μL×108CFU/mL的益生菌-RPMI-1640混合液和200μL濃度為1×107CFU/mL的致病菌-RPMI-1640混合液，只加入致病菌-RPMI-1640混合液作為對(duì)照組，將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板在5%CO2，95%空氣的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2h，之后將益生菌菌液移除，用緩沖溶液PBS清洗三次。將致病菌菌液移出之后加入1mL含有Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）濃度為0.5%的PBS處理5min。然后用緩沖溶液PBS沖洗三次，用1mL的蒸餾水溶解，連續(xù)稀釋后用BHI培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2益生菌耐受胃酸能力測(cè)定參考Mishra等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)益生菌進(jìn)行耐酸性實(shí)驗(yàn)［9-10］。益生菌在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代，使液體培養(yǎng)基中菌的濃度達(dá)到109CFU/mL。取100μL的菌液接種于9.9mL用4mol/L鹽酸酸化到pH1.5、2.0和2.5的液體培養(yǎng)基和未酸化的培養(yǎng)基中（作為對(duì)照），37℃處理90min，之后將樣品稀釋不同的梯度，用瓊脂平板傾注法在厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)，對(duì)比處理前后數(shù)活菌數(shù)的變化。

1.2.3益生菌耐受腸液膽鹽能力測(cè)定參考Ruiz-Moyano等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)益生菌進(jìn)行耐膽鹽實(shí)驗(yàn)［11-12］?；罨瘍纱蟮囊嫔?%接種于含膽汁的液體培養(yǎng)基中（0.3%和0.5%牛膽汁），同時(shí)1%接種于不含膽汁的培養(yǎng)基中作為對(duì)照。37℃條件下處理2h前后分別計(jì)活菌數(shù)。

1.2.4篩選具有黏附能力的益生菌參考Kim等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)益生菌進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)［13-14］。益生菌菌株在MRSC培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)24h，活化三代備用。將益生菌菌液10000r/min離心10min，除去上清液，收集沉淀的菌體，將菌體和RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基重混合，使其濃度達(dá)到108CFU/mL。將長(zhǎng)成單層的六孔組織細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1mL 1×108CFU/mL的益生菌-RPMI-1640混合液，將細(xì)胞培養(yǎng)板在5%CO2，95%空氣的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2h，之后將益生菌移除，用緩沖溶液PBS清洗三次除去未黏附的益生菌，之后加入含有Triton X-100的PBS使細(xì)胞溶解。用100μL的蒸餾水溶解，連續(xù)稀釋后用MRS瓊脂培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后計(jì)算每毫升中活菌的數(shù)量。

1.2.5運(yùn)用16S rDNA技術(shù)分析鑒定益生菌菌株運(yùn)用16S rDNA技術(shù)分析鑒定益生菌菌株的過(guò)程如下：

益生菌基因組DNA的提?。喝√幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的益生菌培養(yǎng)液，5000r/min離心10min。使用DNA提取試劑盒（D3350-01 Bacterial DNA Kit，OMEGA，BIO-TEK）提取益生菌的總DNA。

引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)不同種屬的細(xì)菌的16S rDNA序列兩端的保守性設(shè)計(jì)通用引物：引物1（fD1 primer）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，引物2（rP1primer）：ACGGTTACCTTGTTACGACTT。引物1共20bp堿基，G+C含量為50.00%。引物2共21bp堿基，G+C含量為42.86%。

PCR反應(yīng)條件：PCR共50μL反應(yīng)體系如下：30μL ddH2O，5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液，4μL四種dNTP，4μL MgCl2，1μL上游引物（引物1），1μL下游引物（引物2），4μL模板DNA，1μL Taq TMDNA聚合酶。PCR反應(yīng)步驟：a.94℃熱啟動(dòng)變性5min。b.94℃變性30s。c.57℃退火40s。d.72℃延伸90s。e.重復(fù)步驟b、c和d達(dá)到30次。f.72℃延伸10min，使擴(kuò)增產(chǎn)物完整。

擴(kuò)增產(chǎn)物純度檢測(cè)：配制1%瓊脂糖凝膠，用TAE作為電泳緩沖液，制作10μL反應(yīng)體系。以DL2000分子量為：200、500、800、1000、1500和2000為分子量標(biāo)準(zhǔn)，80V電壓（5V/cm）恒壓電泳，觀察凝膠條帶。

回收16S rDNA目標(biāo)產(chǎn)物：配制1%瓊脂糖凝膠，用TAE作為電泳緩沖液，制作50μL反應(yīng)體系。以DL2000分子量為標(biāo)準(zhǔn)，80V電壓（5V/cm）恒壓電泳。電泳完成后切去DNA片段，用DNA膠回收試劑盒對(duì)16S rDNA片段進(jìn)行回收。

將16S rDNA目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌及測(cè)序：將16S rDNA轉(zhuǎn)入到感受態(tài)大腸桿菌體內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，挑取白色單菌落到50mL三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。從擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液提取16S rDNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選擇條帶較亮的擴(kuò)培菌株送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

2　結(jié)果與分析

2.1抑制致病菌黏附的益生菌的篩選

抑制致病菌黏附是益生菌抑制腹瀉發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，將腸道致病菌從腸道上皮細(xì)胞黏附位點(diǎn)脫落，不僅能夠有效預(yù)防腹瀉的發(fā)生，還能夠降低腹瀉復(fù)發(fā)的概率。致病菌黏附到上皮細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)是其致病的首要條件，因?yàn)橹挥羞@樣才能不被腸道的食物和流體沖走并進(jìn)行后續(xù)的大量生長(zhǎng)和定植，最終引起腹瀉。如果益生菌能夠大幅降低致病菌的黏附效果，則能夠有效地抑制腹瀉的發(fā)生［15-17］。將篩選出的14株益生菌進(jìn)行抑制致病菌黏附實(shí)驗(yàn)，在長(zhǎng)成單層細(xì)胞培養(yǎng)板中同時(shí)加入益生菌和致病菌菌體，兩種菌競(jìng)爭(zhēng)性黏附到細(xì)胞，通過(guò)對(duì)比加入益生菌后致病菌的黏附性能的降低幅度來(lái)篩選抑制效果好的益生菌菌株。益生菌抑制致病菌黏附的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1　篩選出的益生菌進(jìn)行抑制沙門(mén)氏菌黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±SD，n=3）Fig.1　Results of screened probiotics inhibition of Salmonella adhesion（x±SD，n=3）

從圖1可以看出抑制沙門(mén)氏菌黏附能力比L.GG強(qiáng)的菌株有：G15、M7、SB5、J10、Q11、SB33、J5、F0533、F1333、F1321、IN4224和IN4125。其中G15、J5、SB33、F0533、IN4224、IN4125和M7的抑制效果最為顯著，和對(duì)照組6.5×104CFU/mL相比降低到1.0×104CFU/mL，降低了85%左右。將篩選出的7株能夠共同抑制沙門(mén)氏菌黏附的益生菌進(jìn)行耐酸耐膽鹽適應(yīng)腸道環(huán)境的性能評(píng)價(jià)。

2.2益生菌耐酸實(shí)驗(yàn)

益生菌要進(jìn)入人體定植腸道就必須經(jīng)過(guò)胃酸的低酸環(huán)境，人體胃環(huán)境影響益生菌存活的主要是酸水解作用，當(dāng)pH2.5時(shí)胃酸的殺菌作用就很明顯。因此，益生菌必須能夠耐受胃酸的惡劣環(huán)境存活，才能夠到達(dá)腸道定植下來(lái)，發(fā)揮益生功能。由于胃酸最低pH可能達(dá)到1.5，在一定的范圍內(nèi)變化，所以選取不同pH測(cè)定益生菌的耐酸能力［18-20］。從表1可以看出益生菌在pH1.5的條件下處理90min后存活的益生菌為105～106CFU/mL左右，其中J5、IN4125、M7和F0533存活的菌數(shù)能達(dá)到106CFU/mL，M7的菌數(shù)則能達(dá)到將近107CFU/mL，和對(duì)照組正常菌數(shù)109CFU/mL相比，菌數(shù)降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)。

表1　益生菌耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±SD，n=3）Table 1　Effecte of gastric juice on viability of strain（sx±SD，n=3）

益生菌在pH2.0的條件下處理90min后存活的益生菌數(shù)量能達(dá)到106CFU/mL以上，其中J5和M7存活的菌數(shù)能達(dá)到將近108CFU/mL，益生菌菌數(shù)降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)左右。益生菌在pH2.5的條件下處理90min后存活的益生菌數(shù)量達(dá)到108CFU/mL左右，菌數(shù)降低了1個(gè)數(shù)量級(jí)左右。說(shuō)明篩選出的益生菌在胃酸極端的pH環(huán)境下至少能有1%的菌株生存，進(jìn)入人體腸道定植，從而發(fā)揮其益生功能。

2.3益生菌耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

益生菌只有耐受腸道的膽鹽環(huán)境，才能在腸道內(nèi)定植。從表2可以看出在0.3%的膽鹽環(huán)境下存活的益生菌菌數(shù)達(dá)到107CFU/mL，和對(duì)照組對(duì)比降低了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，數(shù)據(jù)表明篩選出的益生菌具有較強(qiáng)的耐受膽鹽能力，其中J5、G15、IN4125、M7和F0533的耐受能力較強(qiáng)，能達(dá)到107CFU/mL以上。而這些益生菌在0.5%的膽鹽環(huán)境下存活數(shù)為106CFU/mL左右，降低了2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。

表2　不同濃度膽鹽對(duì)菌株繁殖能力的影響（x±SD，n=3）Table 2　Effecte of different concentrations of bile salt on growth of strains（x±SD，n=3）

2.4篩選黏附能力強(qiáng)的益生菌

經(jīng)過(guò)胃酸和腸道膽鹽極端環(huán)境條件下存活的益生菌，如果要發(fā)揮益生功能需黏附到腸道上皮細(xì)胞上，因?yàn)橹挥羞@樣才能避免被腸道流體和食物沖洗掉，才能完成在腸道的定植，因此黏附性能是衡量益生菌特性非常關(guān)鍵的指標(biāo)［21］。益生菌的粘附能力如圖2所示。

圖2　篩選出的益生菌黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±SD，n=3）Fig.2　Results of screened probiotics adhesion assay（x±SD，n=3）

從圖2中可以看出益生菌和上皮細(xì)胞混合2h后，對(duì)照組益生菌濃度為109CFU/mL，而黏附到上皮細(xì)胞上的益生菌數(shù)量是104～106CFU/mL左右，其中J5、G15和F0533的黏附能力比L.GG的黏附能力強(qiáng)，黏附到細(xì)胞上的菌數(shù)超過(guò)106CFU/mL，黏附率為0.1%，具備較強(qiáng)的黏附能力。

2.5通過(guò)16SrDNA鑒定益生菌菌株

最終篩選出J5、M7、IN4125、F0533和G15進(jìn)行機(jī)理研究實(shí)驗(yàn)，提取其總DNA并用16S rDNA引物進(jìn)行PCR，得到菌株的16S rDNA，送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，鑒定益生菌所屬的菌屬。經(jīng)過(guò)鑒定J5、M7、IN4125、F0533和G15分別為：Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus casei、Lactobacillusrhamnosus、Lactobacillusparacasei和Lactobacillus paracasei。

3　結(jié)論

從14株潛在的益生菌菌株篩選出能夠抑制致病菌黏附的益生菌，并且對(duì)篩選出來(lái)的7株益生菌耐受腸道環(huán)境進(jìn)行評(píng)價(jià)，即進(jìn)行耐受腸道環(huán)境及其黏附性篩選。首先對(duì)7株菌株耐酸能力評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4株益生菌在pH2的條件下存活的益生菌能夠達(dá)到在107CFU/mL以上。耐膽鹽能力結(jié)果顯示，在0.3%的膽鹽環(huán)境下5株益生菌活菌數(shù)在能夠達(dá)到在107CFU/mL以上。用單層HT-29細(xì)胞模擬腸道環(huán)境進(jìn)行益生菌黏附實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示有3株益生菌能夠?qū)?.1%的益生菌黏附到上皮細(xì)胞上。運(yùn)用16S rDNA基因技術(shù)鑒定五株乳酸菌F0533、IN4125、G15、J5和M7分別為L(zhǎng)actobacillus rhamnosus、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei。

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Screening the probiotics inhibiting the diarrhea caused by pathogens

XUE Chao-hui，ZHANG Lan-wei*，ZHANG Ying-chun，SHAN Yu-juan，WANG Shu-mei，LI Hong-bo
（School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

In this study，fourteen selected Lactobacillus isolated from human intestinal and ferment milk were assessed the ability to inhibit the infection of enteropathogens.The Lactobacillus strains were screened on the basis of probiotic characteristics（i.e.，resistance to low pH and bile salts，adhesion to the human gastrointestinal tract）.By an in vitro system simulating gastric transit，it indicated that the three probiotic strains had the ability to tolerate gastroenteric environment and the adhesive capacity to HT-29 cells.It was demonstrated that the number of 7 probiotics strains could reach about 107CFU/mL after treatment of 90min in pH2 and the number of bacteria strains decreased to one percent of the original after treatment of 0.3%of the bile salt environment 2h. Adhesion of probiotics on number of J5，G15 and F0533 could reach 106CFU/mL，which showed strong adhesion ability.Among the selected strains，five selected Lactobacillus showed a high probiotic potential and could be used in health-promoting food products.After analyzing the sequence of the 16S rDNA regions of these strains，five potential probiotic F0533，IN4125，G15，J5 and M7 were Lactobacillus rhamnosus，Lactobacillus rhamnosus，Lactobacillus paracasei，Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei.

probiotics；Salmonella；inhibition of adhesion；resistance to low pH and bile salts

Q78

A

1002-0306（2015）02-0227-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.040

2014－05－22

薛超輝（1986-），男，博士研究生，研究方向：益生菌篩選及功能性研究。

張?zhí)m威（1961-），男，教授，研究方向：乳制品及益生菌功能。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30871816/C120108）。