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    蓮房多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

    2015-10-21 08:19:32鐘怡平夏道宗王思為方月娟
    食品工業(yè)科技 2015年6期
    關(guān)鍵詞:蓮房勻漿螯合

    鐘怡平,夏道宗,黃 嵐,王思為,方月娟

    (浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州310053)

    蓮房多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

    鐘怡平,夏道宗*,黃嵐,王思為,方月娟

    (浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州310053)

    在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了熱回流提取蓮房多酚的工藝,并通過(guò)測(cè)定其清除ABTS+自由基、DPPH自由基、OH自由基的能力,還原力,亞鐵離子螯合活性及對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響,對(duì)蓮房多酚的抗氧化活性進(jìn)行綜合研究。結(jié)果表明,熱回流提取蓮房多酚的最佳工藝參數(shù)為:乙醇濃度50%,料液比1∶25,提取溫度80℃,提取時(shí)間為2h,最優(yōu)條件下的得率是5.23%。蓮房多酚的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明蓮房多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基、OH自由基有很強(qiáng)的清除能力,對(duì)亞鐵離子的螯合活性和還原力均較強(qiáng),并能顯著抑制大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化。本研究表明在該優(yōu)化工藝下提取的蓮房多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

    蓮房,多酚,提取,抗氧化

    蓮為睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物,是一種常見(jiàn)的藥食兩用經(jīng)濟(jì)作物[1]。蓮類(lèi)藥材(荷葉、蓮房、蓮子、蓮子心、藕節(jié)等)均可作為藥物用來(lái)治療多種疾?。?-3]。我國(guó)蓮資源充足,而作為蓮非可食部分的蓮房卻一直被視為廢棄物丟棄,利用價(jià)值不高。目前關(guān)于蓮房的研究還處于起步階段,開(kāi)發(fā)蓮房不僅具有一定的科學(xué)價(jià)值,還會(huì)帶來(lái)不錯(cuò)的經(jīng)濟(jì)效益。有報(bào)道稱,蓮房中富含多酚,對(duì)蓮房多酚的開(kāi)發(fā)研究空間很大,值得深入考察[4-6]。此外,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)在蓮源花青素領(lǐng)域的研究也成果頗豐。植物多酚可以通過(guò)減少自由基的產(chǎn)生而削弱自由基對(duì)機(jī)體的損傷,因此該類(lèi)化合物在醫(yī)藥和保健方面必將有廣泛的應(yīng)用[7-8]。本文采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了熱回流提取蓮房多酚的工藝,并通過(guò)測(cè)定其清除ABTS+自由基、DPPH自由基和OH自由基的能力,結(jié)合亞鐵離子螯合活性和還原力測(cè)定,以及對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響,從化學(xué)、生物學(xué)角度對(duì)蓮房多酚的抗氧化活性進(jìn)行綜合研究,為進(jìn)一步利用和研究蓮房提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料與儀器

    蓮房采自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司,產(chǎn)地湖南;1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、二銨鹽自由基(ABTS)、2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ) 美國(guó)Sigma-A ldrich公司;乙醇、福林酚試劑、無(wú)水碳酸鈉、沒(méi)食子酸、抗壞血酸、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸、鹽酸、FeCl3、FeSO4、H2O2、KH2PO4、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、Ferrozine、D-脫氧核糖、EDTA-2Na等。

    FA2004電子分析天平上海菁海儀器有限公司;R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申勝生物技術(shù)有限公司;低溫冷卻液循環(huán)泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海尤尼柯儀器有限公司;GZX-9140 MBE恒溫干燥箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1多酚含量的測(cè)定沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確吸取濃度為100μg/m L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8m L于10m L比色管中,加入5m L福林酚試劑、4m L 75g/L的Na2CO3溶液。旋渦混勻15s后,用蒸餾水定容至刻度,40℃放置30m in,顯色。用分光光度計(jì)測(cè)定775nm的吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。

    蓮房多酚含量測(cè)定:準(zhǔn)確稱取已過(guò)20目篩的蓮房粉末2g,加入一定量一定濃度乙醇,于一定溫度下提取,提取一定時(shí)間后進(jìn)行抽濾,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),蒸餾水定容至50m L,取1m L定容至100m L,取1m L待測(cè)液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定總酚含量。

    蓮房多酚得率(%)=(樣液中多酚含量(mg/L)×樣液體積(L)×稀釋倍數(shù))÷蓮房質(zhì)量(mg)×100

    1.2.2單因素提取實(shí)驗(yàn)為研究乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度四個(gè)因素對(duì)蓮房多酚得率的影響,分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2.1乙醇濃度對(duì)蓮房多酚提取效果的影響采用0、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%八個(gè)水平,料液比1∶20,在水浴溫度60℃條件下提取1h。

    1.2.2.2提取溫度對(duì)蓮房多酚提取效果的影響采用40、50、60、70、80、90℃六個(gè)水平。以60%乙醇溶液為溶劑,料液比1∶20提取1h。

    1.2.2.3提取時(shí)間對(duì)蓮房多酚提取效果的影響采用0.5、1、1.5、2、2.5、3h六個(gè)水平,以60%乙醇溶液為溶劑,料液比1∶20,在水浴溫度80℃條件下提取。

    1.2.2.4料液比對(duì)蓮房多酚提取效果的影響采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40七個(gè)水平,以60%乙醇溶液為溶劑,在水浴溫度80℃條件下提取1h。

    1.2.3正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度作為正交實(shí)驗(yàn)的四個(gè)因素,每個(gè)因素取三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化,因素水平表見(jiàn)表1。

    表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels design of orthogonal experiment

    1.2.4體外抗氧化實(shí)驗(yàn)將蓮房多酚配制成八個(gè)濃度500、250、100、50、25、10、5、2.5μg/m L。配制陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸(1mg/m L):稱取10.0mg抗壞血酸,用蒸餾水定容至10m L。即1000μg/m L,然后稀釋成500、250、 100、50、25、10、5μg/m L系列濃度。

    1.2.4.1清除DPPH自由基能力的測(cè)定[9-10]準(zhǔn)確稱取20mg DPPH自由基,用無(wú)水乙醇溶解配制成2× 10-4mol/L的溶液(253.6m L)。取等體積(2m L)待測(cè)液及2×10-4mol/L DPPH溶液加入同一具塞試管中,搖勻。室溫下避光放置30m in后用無(wú)水乙醇做參比在517nm下測(cè)定其吸光度Ai,同時(shí)測(cè)定2×10-4mol/L DPPH溶液與等體積無(wú)水乙醇(2m L)混合液的吸光度Ac,以及待測(cè)液(2m L)與等體積無(wú)水乙醇混合液的吸光度Aj。根據(jù)式(1)計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率,求取試樣清除DPPH自由基的IC50。

    DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)]/Ac×100

    1.2.4.2清除ABTS+自由基的能力測(cè)定[11]取0.4m L不同濃度的樣品溶液,加入3.6m L 0.0875mmol/L ABTS溶液,漩渦混合后于暗處?kù)o置10m in,測(cè)定734nm的吸光值。對(duì)照管以0.4m L 70%乙醇替代樣品。根據(jù)式(2)計(jì)算清除率,并求取試樣清除ABTS+自由基的IC50。

    1.2.4.3還原力的測(cè)定—鐵離子還原法[12]吸取系列濃度FeSO4溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取100μL待測(cè)樣品,與3m L FRAP溶液混合,再加300μL體積蒸餾水,在37℃水浴中反應(yīng)4m in,于593nm波長(zhǎng)下讀取吸光值,并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得待測(cè)樣品相應(yīng)的FeSO4濃度,定義為當(dāng)量濃度(FRAP值)。結(jié)果表示為每mg樣品中相當(dāng)于的FeSO4的量。

    1.2.4.4清除OH自由基能力的測(cè)定[13]取0.1m L不同濃度的樣品水溶液,加入0.690m L 20mmol/L pH7.4的KH2PO4-KOH緩沖液(含2.5mmol/L 2-脫氧核糖),然后加入0.1m L預(yù)先混合的1.0mmol/L硫酸亞鐵和1.04mmol/L EDTA(1∶1體積混合)。(反應(yīng)液保持37℃溫浴,常溫放置)加入0.1m L 1.0mmol/L的抗壞血酸和0.01m L 0.1mol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng),37℃下溫浴30m in。取出后加入1%硫代巴比妥酸1m L和2.8%三氯乙酸1.0m L,95℃下反應(yīng)15m in以產(chǎn)生顏色。取出立即冷卻,532nm測(cè)吸光值。對(duì)照管以0.1m L蒸餾水代替樣品。

    1.2.4.5亞鐵離子螯合活性測(cè)定[12]0.2m L不同濃度的樣品溶液中加入0.2m L 50μmol/L FeSO4和1.4m L 0.15mol/L NaCl溶液,加入0.2m L 300μmol/L菲咯嗪?jiǎn)?dòng)反應(yīng),劇烈振搖后(漩渦混合5s),室溫下放置10m in。測(cè)定562nm的吸光值,若吸光值越低,表示對(duì)鐵離子的螯合能力越強(qiáng)??瞻坠苡?.2m L 0.15mol/LNaCl代替菲咯嗪。

    1.2.4.6對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響(丙二醛含量及抑制率的測(cè)定)[13]大鼠處死后,在冰臺(tái)上快速取腦,稱重,加10倍量生理鹽水勻漿,制備10%腦勻漿液。取10%新鮮腦勻漿0.6m L,加0.4m L生理鹽水,漩渦混勻,加入0.3m L不同濃度的樣品溶液,加入0.3m L 1mmol/L Fe2SO4,加入0.3m L 10mmol/L H2O2,在37℃下水浴1h后,加入1m L 15%三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng),3000r/m in離心15m in,得上清液,取1.5m L上清液,加入1.0m L 1%的硫代巴比妥酸,100℃反應(yīng)15m in。冷卻(固定冷卻時(shí)間),用分光光度計(jì)測(cè)定532nm的吸光值。對(duì)照管以0.3m L蒸餾水代替樣品。根據(jù)TBA-MDA產(chǎn)物(TBARS)的摩爾消光系數(shù)1.56× 105(mol/L)-1·cm-1計(jì)算MDA的濃度。

    1.2.4.7數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均測(cè)定三次,取平均值;采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1回歸方程確立

    以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),以其吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=0.0147X+0.0190(R2=0.9993)

    2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

    2.2.1乙醇濃度對(duì)蓮房多酚提取效果的影響由圖1可見(jiàn),隨著乙醇濃度增大,蓮房多酚得率呈先上升后下降趨勢(shì),這可能是因?yàn)樯彿慷喾咏Y(jié)構(gòu)復(fù)雜,極性跨度范圍較大,溶劑極性過(guò)大或過(guò)小對(duì)總多酚提取均有一定的影響,從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,當(dāng)乙醇濃度為60%左右時(shí),提取率達(dá)最大值。

    圖1 不同乙醇濃度對(duì)蓮房多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield

    2.2.2溫度對(duì)蓮房多酚提取效果的影響由圖2可見(jiàn),隨著溫度升高,蓮房多酚得率升高,當(dāng)提取溫度為80℃時(shí),蓮房多酚得率最高,溫度升高加快分子運(yùn)動(dòng)速度,有利于細(xì)胞中多酚物質(zhì)的溶出。但當(dāng)溫度再度升高,得率反而下降,這可能是由于高溫導(dǎo)致了部分蓮房多酚的氧化。

    圖2 不同提取溫度對(duì)蓮房多酚得率的影響Fig.2 Effectof extraction temperature on extraction yield

    2.2.3提取時(shí)間對(duì)蓮房多酚提取效果的影響由圖3可見(jiàn),提取時(shí)間越長(zhǎng),蓮房多酚提取越充分,效率越高,但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致多酚的氧化損耗,最佳提取時(shí)間在1h左右。

    圖3 不同提取時(shí)間對(duì)蓮房多酚得率的影響Fig.3 Effectof extraction time on extraction yield

    2.2.4料液比對(duì)蓮房多酚提取效果的影響由圖4可見(jiàn),多酚得率隨著料液比加大而增大,當(dāng)料液比達(dá)1∶25時(shí),趨勢(shì)不再顯著,趨于穩(wěn)定,這可能是因?yàn)榱弦罕冗_(dá)到1∶25時(shí),溶劑對(duì)多酚的溶解基本達(dá)到飽和,考慮到成本,可選1∶25為最佳料液比。

    圖4 不同料液比對(duì)蓮房多酚得率的影響Fig.4 Effectof solid-liquid ratio on extraction yield

    2.3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度四個(gè)因素,每個(gè)因素取三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。

    由表可知,四個(gè)因素對(duì)蓮房多酚物質(zhì)得率的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛龋緶囟龋玖弦罕龋緯r(shí)間,由于因素B料液比的第2、3個(gè)水平的k值相等,考慮到經(jīng)濟(jì)性,故選擇B2作為其優(yōu)水平。因此,最佳提取工藝為A1B2C3D2,即用50%的乙醇,以1∶25的料液比于80℃提取2h,所得蓮房多酚的得率最高,為5.23%。

    表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

    表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

    2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    稱取2g蓮房多酚,按最佳工藝A1B2C3D2進(jìn)行提取,進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為5.19%、5.21%、5.30%,其平均提取率為5.23%,比正交實(shí)驗(yàn)中含量最高的一組高出0.05%,表明通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)選擇出的最佳提取工藝科學(xué)合理,重現(xiàn)性好。

    2.5體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

    2.5.1清除DPPH自由基能力如圖5所示,蓮房多酚(TPNU)可以顯著抑制DPPH自由基的產(chǎn)生,且在一定范圍內(nèi)具有量效關(guān)系,其IC50=9.03μg/m L,而陽(yáng)性對(duì)照VC的IC50=12.44μg/m L。TPNU清除DPPH自由基能力略大于VC。鄭麗鋆等[14]研究了蓮房不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用,其中乙醇提取物的IC50值為12.94μg/m L,分析其造成差異的主要原因可能與不同品種和不同產(chǎn)地的蓮房總多酚含量不同有關(guān)。

    圖5 蓮房多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 Capacity of DPPH free radical scavenging by TPNU

    2.5.2清除ABTS+自由基的能力如圖6所示,TPNU可有效抑制ABTS+自由基的產(chǎn)生,且在一定范圍內(nèi)具有量效關(guān)系,其IC50=26.38μg/m L,而陽(yáng)性對(duì)照VC的IC50=17.29μg/m L。TPNU清除ABTS+自由基能力比VC略小,但仍有較強(qiáng)的清除ABTS+自由基的能力。

    圖6 蓮房多酚對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Capacity of ABTS+free radical scavenging by TPNU

    2.5.3還原力由圖7可知,TPNU具有一定的還原力,但比陽(yáng)性對(duì)照VC較小,分別為5.27、9.33μmol/mg。

    圖7 蓮房多酚的還原力Fig.7 Reducing power of TPNU

    2.5.4清除OH自由基能力OH自由基是已知的最活潑的活性氧自由基,也是毒性最大的氧自由基,會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用及造成生物損傷[15-16]。由圖8可知,蓮房多酚濃度為100μg/m L時(shí),清除率達(dá)到了50%,稍低于VC。

    2.5.5亞鐵離子螯合活性鐵被認(rèn)為是脂質(zhì)氧化的重要促進(jìn)劑。對(duì)亞鐵離子的螯合,可以保護(hù)鐵誘導(dǎo)的氧化損傷[17]。由圖9可知,蓮房多酚對(duì)亞鐵離子的螯合小于EDTA,但仍具有較強(qiáng)螯合性,濃度為50mg/L時(shí),螯合率達(dá)43.2%。

    2.5.6對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響由圖10可知,蓮房多酚對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化抵抗能力與VC相當(dāng)(最高清除率相等),具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。

    圖8 蓮房多酚對(duì)OH自由基的清除能力Fig.8 Capacity of hydroxy free radical scavenging by TPNU

    圖9 蓮房多酚對(duì)亞鐵離子螯合活性Fig.9 Ferrous ion-chelating capacity by TPNU

    圖10 蓮房多酚對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響Fig.10 Influence on lipid peroxidation in rats of TPNU

    3 結(jié)論

    在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)蓮房多酚提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,水浴回流提取蓮房多酚的最佳工藝參數(shù)為:乙醇濃度50%,料液比1∶25,提取溫度80℃,提取時(shí)間為2h,得率最高為5.23%。蓮房多酚的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明蓮房多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基和OH自由基均具有良好清除作用,清除DPPH自由基能力略大于VC,具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用且具有一定的還原力和亞鐵離子螯合活性。表明蓮房多酚是一種良好的天然抗氧化劑。本研究為工業(yè)化利用豐富的蓮房資源提取蓮房多酚提供了依據(jù)。

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    Study on the extraction and antioxidant activity of total phenolic com pounds from the seedpod of Nelumbo Nucifera Gaertn

    ZHONG Yi-ping,XIA Dao-zong*,HUANG Lan,WANG Si-wei,F(xiàn)ANG Yue-juan
    (College of Pharmaceutical Sciences,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

    The extraction technology of total phenolic com pounds from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn(TPNU)was studied by sing le-fac tor experiments and orthogonal test design.Furthermore,the antioxidant activities of TPNU were evaluated,using various antioxidant assays inc luded the scavenging on DPPH,ABTS+,OH free rad icals,reducing power determ ination,ferrous ion-chelating capacity and influence on lip id peroxidation in rats.The results showed that the op timum extrac tion cond itions were determ ined by orthogonal experiment as follows:ethanol concentration 50%,solid-liquid ratio 1∶25,extraction tem perature 80℃ and extraction time 2h,and the extrac tion yield was 5.23%in these conditions.TPNU had strong scavenging activity on DPPH,ABTS+and OH free rad icals,also had strong reducing power and ferrous ion-chelating capacity.In addition,TPNU could significantly inhibit the b rain lipid peroxidation in rats.These findings showed that TPNU had strong antioxidantactivity under the op timalextraction technology.

    seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn;totalphenolic com pounds;extraction;antioxidantactivity

    TS201.1

    B

    1002-0306(2015)06-0235-05

    10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.044

    2014-07-07

    鐘怡平(1992-),女,本科,研究方向:功能性食品。

    夏道宗(1978-),男,博士,副教授,研究方向:天然產(chǎn)物與功能性食品。

    國(guó)家自然科學(xué)基金(81374048,81102861);國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目暨浙江省新苗人才計(jì)劃(2013R410018,2014R410003)。

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