基于旋光法的原料乳中乳糖摻偽鑒別技術(shù)研究

鄭向華，楊自潔，龔吉軍，，，*，張青燕，鄧放明，肖蓮榮

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004；2.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局科學(xué)研究院，福建廈門361026；3.湖南亞華乳業(yè)有限公司，湖南長沙410013；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)博士后流動站，湖南長沙410128）

基于旋光法的原料乳中乳糖摻偽鑒別技術(shù)研究

鄭向華2，楊自潔1，龔吉軍1，3，4，*，張青燕3，鄧放明4，肖蓮榮3

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004；2.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局科學(xué)研究院，福建廈門361026；3.湖南亞華乳業(yè)有限公司，湖南長沙410013；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)博士后流動站，湖南長沙410128）

旨在建立一種簡便、高效的原料乳乳糖摻偽鑒別方法。以三氯乙酸為沉淀劑進(jìn)行前處理，借助旋光儀，在589.30～589.44nm下，測定標(biāo)準(zhǔn)乳糖溶液的旋光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了一種基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的原料乳乳糖摻偽定量鑒別法。所得回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，平均回收率達(dá)99.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.67%。與萊因-埃農(nóng)氏法進(jìn)行比對實(shí)驗(yàn)，結(jié)果無差異，但更快捷，成本更低。研究結(jié)果提示，本文所建方法實(shí)用、可靠。

原料乳，乳糖，旋光法，摻偽檢測

乳糖是原料乳中的主要碳水化合物，是半乳糖經(jīng)β-1，4糖苷鍵與葡萄糖結(jié)合而成的還原性二糖。乳糖的主要功能是為人體供給熱能，此外，還可促進(jìn)機(jī)體尤其是嬰幼兒對鈣的吸收，而乳糖分解生成的半乳糖是組成大腦配糖體的重要成分。因此，其對嬰兒的生長發(fā)育具有重要的作用［1-2］。乳糖含量雖然不是國家生鮮乳收購標(biāo)準(zhǔn)中的檢測項(xiàng)目，但為防止原料乳摻假，乳品企業(yè)在收購時大多將其列為檢測項(xiàng)目［3］。

目前乳制品中碳水化合物測定的國家標(biāo)準(zhǔn)方法是GB5413.5-2010，有關(guān)乳糖的檢測方法有兩種，一是高效液相色譜法，二是萊因-埃農(nóng)氏法。高效液相色譜法高效且準(zhǔn)確，但設(shè)備昂貴，檢測費(fèi)用相對較高；而萊因-埃農(nóng)氏法，較繁瑣、費(fèi)時，且不易判斷終點(diǎn)。因此，建立一種更便捷且準(zhǔn)確的原料乳及乳制品中乳糖檢測/鑒別法，具現(xiàn)實(shí)意義。經(jīng)典旋光法是測定牛乳中乳糖含量的傳統(tǒng)方法之一［4］，但該方法冗長費(fèi)時、不易操作，工作效率較低。為此，筆者將經(jīng)典旋光法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一種高效、簡便、低成本的原料乳中乳糖摻偽鑒別方法，以期為原料乳生產(chǎn)實(shí)踐中的摻偽鑒別提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乙酸鉛、草酸鉀、磷酸氫二鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳糖國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生乳、乳清粉（乳糖含量為72.92g/100g） 湖南亞華乳業(yè)有限公司提供；以上試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；實(shí)驗(yàn)用水均為純水。

AR2140電子分析天平上海力衡儀器儀表有限公司；1600型分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL80-2B高速離心機(jī)上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；WZZ-2A型數(shù)字自動旋光儀上海壘固儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1沉淀劑對乳糖溶液旋光度的影響參考文獻(xiàn)［5］的方法，選用濃度24%三氯乙酸作為沉淀劑。分別向100m L濃度為1mg/m L的乳糖溶液中（其中添加3.0g全脂奶粉）加入濃度24%三氯乙酸4、5、6m L，搖勻，靜置5min，放入2dm旋光管中，每小時測定1次旋光度，考察沉淀劑對旋光度的影響，以確定最佳的沉淀劑添加量與檢測時間。以蛋白質(zhì)沉淀率來表示沉淀劑的沉淀效果。

蛋白質(zhì)沉淀率（%）=沉淀物中所含蛋白質(zhì)質(zhì)量/被測體系中所含蛋白質(zhì)質(zhì)量×100。

1.2.2乳糖溶液配制及前處理乳糖在80℃下，烘2h，備用。分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0、3.0g乳糖，用蒸餾水定容至100m L，充分搖勻，配制系列濃度的乳糖溶液。加入濃度24%三氯乙酸5m L，搖勻，靜置10min后，過濾，濾液備用。

1.2.3乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制依次移取1.2.2中所得濾液置于2dm旋光管中，在589.30～589.44nm［6］測定旋光度。以乳糖濃度為橫坐標(biāo)，旋光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4回收率實(shí)驗(yàn)在10m L原料乳中，分別摻入乳糖10.00、20.00、30.00、50.00、70.00、100.00、150.00、200.00、300.00mg，用蒸餾水定容至100m L。采用前述方法進(jìn)行前處理后，用旋光儀測定旋光度，每個濃度梯度重復(fù)測定5次。

1.2.5精密度實(shí)驗(yàn)在10m L原料乳中，添加30.00mg乳糖，用蒸餾水定容至100m L，充分搖勻。采用前述方法進(jìn)行前處理后，用旋光儀測定旋光度。重復(fù)6次。

1.2.6與萊因-埃農(nóng)氏法的比對實(shí)驗(yàn)在兩份10m L原料乳中，分別添加30.00mg乳糖和40.00mg乳清粉，用蒸餾水定容至100m L。用前述方法進(jìn)行前處理后，采用所建旋光法測定樣品中乳糖的含量。同時參照國標(biāo)GB5413.5-2010中萊因-埃農(nóng)氏法進(jìn)行比對實(shí)驗(yàn)。每種方法設(shè)6次重復(fù)，據(jù)測定結(jié)果計(jì)算回收率，依此進(jìn)行檢測效果比對。

1.2.7數(shù)據(jù)處理采用PASW Statistics軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1溫度對旋光度的影響

就大多數(shù)光學(xué)活性物質(zhì)而言，當(dāng)溫度升高1℃時，旋光率約減小千分之幾，一些利用旋光法檢測碳水化合物的研究中，探究了溫度對測定結(jié)果的影響，并計(jì)算出了溫度校正系數(shù)［6-7］。朱亞菲［8］報道，在24～60℃的范圍內(nèi)，溫度對蔗糖的旋光度基本無影響。而童殿榮［9］在用旋光法測定新鮮牛乳中乳糖的研究中，亦得出了相似的結(jié)論。對此，筆者也進(jìn)行了大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的旋光法，在10～30℃的條件下，溫度對旋光度的影響可忽略。故此，在本項(xiàng)研究中，不考慮溫度對旋光度的影響。

2.2沉淀劑對乳糖溶液旋光度的影響

目前，乳制品中乳糖檢測時常用的蛋白沉淀劑有硫酸鋅-氫氧化鋇、乙酸鋅-亞鐵氰化鉀和硫酸鋅-氫氧化鈉［2，10］。伍桃英等［11］的研究認(rèn)為，乙酸鉛和草酸鉀-磷酸氫二鈉沉淀蛋白質(zhì)的效果較好。而劉志祥等［12］用旋光法測定乳清粉中乳糖時發(fā)現(xiàn)，即使不加沉淀劑，亦可獲得滿意的效果。在參考謝家興［5］及預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本文采用了24%三氯乙酸作為蛋白沉淀劑。而三氯乙酸為酸性，其對乳糖溶液的旋光度是否有影響，未見文獻(xiàn)報道。

三氯乙酸的加入量對乳糖溶液的旋光度影響的測定結(jié)果見表1。由表1可見，在相同的時間，隨著24%三氯乙酸添加量的增加，三個樣品的旋光度有所增大。隨著時間的延長，三個樣品旋光度值的變化趨勢基本一致，即旋光度先快速降低，后變化幅度減緩至趨于穩(wěn)定；添加量為4、5m L/100m L時，3h后趨于穩(wěn)定，添加量為6m L/100m L時，2h后趨于穩(wěn)定。

表1　不同三氯乙酸添加量對應(yīng)的旋光度Table 1　The optical rotation under different contents of trichloroacetic acid

蛋白質(zhì)沉淀率測定結(jié)果見表2。表2的結(jié)果表明，隨著三氯乙酸的添加量增加，蛋白質(zhì)沉淀率上升，當(dāng)添加量為5m L/100m L時，已基本沉淀完全。

表2　蛋白質(zhì)沉淀率測定結(jié)果（±SD，n=5）Table 2　The data of precipitation rate of raw milk protein（±SD，n=5）

表2　蛋白質(zhì)沉淀率測定結(jié)果（±SD，n=5）Table 2　The data of precipitation rate of raw milk protein（±SD，n=5）

注：同行不同小寫字母表示差異顯著（p＜0.05），相同則差異不顯著（p＞0.05）；表5同。

指標(biāo)　24%三氯乙酸添加量（mL/100mL）4 5 6蛋白質(zhì)沉淀率（%）　94.3±0.2a　99.5±0.1b　99.9±0.1b

綜合旋光度變化與沉淀效果的情況，最終確定24%三氯乙酸的適宜添加量為5m L/100m L，濾液上機(jī)檢測前需靜置3h。

2.3乳糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

乳糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。在0～3.0g/100m L的范圍內(nèi)，回歸方程y=0.5198x+0.0101，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，說明此標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性好。

圖1　乳糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of lactose solution

2.4回收率實(shí)驗(yàn)

回收率測定結(jié)果見表3。由表3可見，乳糖的平均加標(biāo)回收率在97.5%～100.9%之間，綜合平均回收率為99.0%。

2.5精密度實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證所建方法的可靠性，進(jìn)行了精密度實(shí)驗(yàn)。剔除原料乳本身所含乳糖（即本底值）后，測定結(jié)果如表4所示。表4的結(jié)果表明，原料乳重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的RSD在1%以內(nèi)，說明該方法的精密度高。同時，精密度實(shí)驗(yàn)中的回收率也很高。這一結(jié)果提示，本法精確可靠。

表3　乳糖摻偽原料乳回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　Results of recovery experimentof lactose in raw milk

表4　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4　Results of the precision test

表5　比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±SD，n=6）Table 5　The results of comparison tes（tx±SD，n=6）

2.6與萊因-埃農(nóng)氏法的比對實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本文所建立方法的準(zhǔn)確性與實(shí)用性，將此法與國家標(biāo)準(zhǔn)GB5413.5-2010中萊因-埃農(nóng)氏法進(jìn)行了比對實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。表5的結(jié)果表明，采用兩種不同方法所得結(jié)果沒有顯著差異（p＞0.05）。因?qū)η疤幚磉M(jìn)行了改良，整體來講本文所建方法總耗時比萊因-埃農(nóng)氏法要短，且所用試劑明顯比后者要少，故更為快捷、經(jīng)濟(jì)。比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在檢測條件較為簡陋的中小企業(yè)或奶站，本文建立的方法具有很高的推廣利用價值。

3　結(jié)論

在0～3.0g/100m L，本文建立的旋光法測定原料乳中乳糖摻偽的線性回歸方程為y=0.5198x+0.0101，R2為0.9993，線性相關(guān)性好。通過回收率實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)以及與現(xiàn)行國標(biāo)方法即萊因-埃農(nóng)氏法的比對實(shí)驗(yàn)，證實(shí)該方法是一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的定量鑒別方法，同時，該方法還具有成本低、對檢測人員要求不高的優(yōu)點(diǎn)，因而具有較高的實(shí)用價值。

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Study on the technology of identify the lactose adulteration in raw m ilk based on polarimetric method

ZHENG Xiang-hua2，YANG Zi-jie1，GONG Ji-jun1，3，4，*，ZHANG Qing-yan3，DENG Fang-m ing4，XIAO Lian-rong3
（1.College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China；2.Institute，Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026，China；3.Post-doctoralWorking Station，Hunan AWA Dairy Co.，Ltd.，Changsha 410013，China；4.Post-DoctoralMobile Station of Biology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

This paper was aimed to set a sim p le and highly-efficientmethod for lactose adulteration detection in raw m ilk.After p retreatment using trichloroacetic acid as p recipitant，at 589.30～589.44nm，the op tical rotation was measured by polarimeter to create standard curve about standard lac tose solution.So as to estab lish a polarimetric method for quantitative detection of the lactose adulteration in raw m ilk based on standard curve. The correlation coefficent（R2）of this regression equation acquired in our study was equivalent to 0.9993；the average recovery rate was 99.0%；the relative standard deviation was 0.67%.In the comparison test，the results showed no significant difference between the Laing Henon'method and the one estab lished in this study，

raw m ilk；lactose；polarimetric method；adulteration detection

TS252.7

A

1002-0306（2015）06-0075-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.008

2014-09-01

鄭向華（1976-），女，碩士研究生，高級工程師，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

龔吉軍（1972-），男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全，天然食品保鮮劑開發(fā)與利用。

國家十二五科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD12B04）；國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK186）。

but the latter was sim p ler and cheaper than the former.It was suggested that such method was p ractical and reliab le.