糜子中還原糖含量測定方法的對(duì)比研究

田翔+喬治軍+王君杰

摘 要：為了測定糜子中還原糖含量，通過試驗(yàn)建立了3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法。對(duì)DNS法中樣品前處理的影響因素，如提取液及溫度進(jìn)行了考察，并進(jìn)行了精密度與回收率試驗(yàn)，測得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.007 7，變異系數(shù)為0.011 7，回收率范圍85.0%～100%。結(jié)果表明，DNS法具有較好的穩(wěn)定性與靈敏度，可代替國標(biāo)GB/T 5513—2008鐵氰化鉀法，適用于試驗(yàn)室糜子還原糖含量的測定。

關(guān)鍵詞：糜子；還原糖；鐵氰化鉀法；比色法；3，5-二硝基水楊酸

中圖分類號(hào)：S516 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.10.002

Abstract：In order to determine the content of reducing sugar in prosomillet， employed 3， 5-dinitrosalicylic acid （DNS） colorimetric method in this paper. The influence factors of sample pretreatment， such as extract volume and temperature was investigated. Measured the standard deviation was 0.007 7， the variation coefficient was 0.011 7， the values of recovery was in the range of 85.0%～100%. The results showed that the DNS method had good stability and sensitivity， could substitute potassium ferricyanide method in GB/T 5513—2008 and applicable to lab prosomillet determination of reducing sugar content .

Key words：prosomillet；reducing sugar；potassium ferricyanide method；colorimetric method；3， 5-dinitrosalicylic acid （DNS）

糖類是糜子的主要成分，占其干質(zhì)量的70%～80%。糜子中的還原糖尤以葡萄糖和果糖最為重要。糜子中還原糖含量的測定至今未見報(bào)道。谷物中還原糖含量測定的常規(guī)方法是鐵氰化鉀法與斐林試劑法[1-3]。本研究首先用鐵氰化鉀法對(duì)糜子中還原糖含量進(jìn)行測定。由于比色法測定食品中的還原糖含量具有測定速度快、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，因此得到廣泛應(yīng)用，如砷鉬酸比色法和3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法。DNS比色法的基本原理是：3，5-二硝基水楊酸在堿性溶液中被還原糖還原成氨基化合物，在沸水浴中顯色5 min后，在530 nm波長下有最大吸收峰。以其吸光度值與溶液還原糖含量成正比為依據(jù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品濃度。試驗(yàn)對(duì)提取劑乙醇用量、提取溫度等反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立3，5-二硝基水楊酸比色法測定糜子中還原糖含量[4-8]，以獲得可靠的數(shù)據(jù)為糜子中還原糖含量測定及品質(zhì)篩選鑒定提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品材料：山西省農(nóng)科院糜子課題提供晉黍1號(hào)，晉黍4號(hào)，晉黍7號(hào)。

1.2 試驗(yàn)試劑

乙醇、乙酸、鎢酸鈉、鐵氰化鉀、碳酸鈉、氯化鉀、硫酸鋅、碘化鉀、氫氧化鈉、淀粉、硫代硫酸鈉、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉，以上試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器

漩渦混合器（VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器）；電子天平（BSA124S，德國Sartorius）；紫外可見分光光度計(jì)（SP-756， 上海光譜儀器）；高速離心機(jī)（5804R ， Eppendorf）；恒溫水浴鍋（HHS， 上海博迅）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 鐵氰化鉀法 樣品溶液的配制：準(zhǔn)確稱取糜子樣品5.675 g，用5 mL乙醇潤濕分散，加入50 mL乙酸緩沖液，振蕩搖勻，加入2 mL鎢酸鈉溶液，漩渦混合器上振蕩5 min，將混合液在中速定性濾紙上過濾，濾液即為樣品液?？瞻滓翰患訕悠?，其余操作同上。

在含5 mL樣液的試管中加入5 mL鐵氰化鉀溶液，沸水浴20 min后迅速冷卻進(jìn)行氧化。將氧化操作后的物質(zhì)傾入100 mL錐形瓶，并用25 mL乙酸鹽溶液洗滌試管，一并傾入錐形瓶，加5 mL 10%的碘化鉀溶液，立即用0.1 mol·L-1硫代硫酸鈉溶液進(jìn)行滴定至淡黃色后加1 mL淀粉溶液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失?？瞻自囼?yàn)中不含樣品，其余操作相同。分別得到V1 與V0，利用公式計(jì)算得到鐵氰化鉀體積，查表對(duì)照得到還原糖含量。

1.4.2 3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法 樣品處理方法：準(zhǔn)確稱取糜子樣品粉末2.000 g，加 95%乙醇10 mL，60 ℃水浴中提取20 min，其間搖動(dòng)數(shù)次。以12 000 r·min-1離心10 min，上清液備用。

還原糖含量測定：用移液器吸取樣液1 mL，加3，5-二硝基水楊酸溶液1 mL，搖勻，置沸水中煮5 min，取出后迅速冷卻，加蒸餾水至10 mL，用未加樣液的試管作空白，調(diào)零，用紫外可見分光光度計(jì)在530 nm波長處測定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵氰化鉀法

2.1.1 還原糖含量的計(jì)算 氧化樣品液中還原糖消耗0.1 mol·L-1鐵氰化鉀溶液體積（V3）的計(jì)算公式：

式中，V0為滴定空白樣液消耗0.1 mol·L-1硫代硫酸鈉溶液的體積；V1為滴定樣品液消耗0.1 mol·L-1硫代硫酸鈉溶液的體積，單位均為mL。根據(jù)GB/T 5513—2008表A.1可查得0.1 mol·L-1鐵氰化鉀體積對(duì)應(yīng)的還原糖含量[1]。

按照同樣方法平行操作兩次，測定結(jié)果求平均值，結(jié)果見表1。

2.2 3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法

2.2.1 3，5-二硝基水楊酸比色法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制一系列含不同濃度葡萄糖的溶液，加1 mL 3，5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴5 min，取出迅速冷卻并加水定容至10 mL。顯色15 min后測定530 nm處吸光度值。

根據(jù)葡萄糖含量與吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖1。如圖1所示，葡萄糖含量與吸光度值有較好的線性關(guān)系，y=1.710 7x-0.055 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6。所以可以利用3，5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行樣品中還原糖的測定。

2.2.2 還原糖含量計(jì)算公式 還原糖（以葡萄糖計(jì)）=（葡萄糖毫克數(shù)×稀釋倍數(shù)×提取體積）/（樣品質(zhì)量×1 000 ×顯色體積） ×100%。

2.2.3 優(yōu)化樣品處理?xiàng)l件 樣品處理過程中乙醇用量對(duì)糜子中還原糖的提取率影響較大，因此分別考察了不同料液質(zhì)量比（樣品∶乙醇）情況下還原糖含量測定結(jié)果，見表2。由圖2可知，當(dāng)樣品與乙醇的質(zhì)量比為1∶5時(shí)糜子中還原糖的提取較完全。

水浴溫度同樣對(duì)還原糖測定結(jié)果產(chǎn)生影響，因此確定樣品與乙醇的質(zhì)量比為1∶5，分別測定水浴溫度為60，70，80，90，100 ℃時(shí)晉7號(hào)糜子的還原糖含量。由圖2可知，溫度為60 ℃提取率最大，溫度過高導(dǎo)致還原糖含量測定結(jié)果偏低，因此選擇60 ℃作為提取溫度。

2.2.4 在優(yōu)化條件下測定樣品 稱取樣品2 g，加入乙醇提取液10 mL，提取還原糖的水浴溫度為60 ℃，利用3，5-二硝基水楊酸比色法分別測定晉黍1號(hào)、晉黍4號(hào)、晉黍7號(hào)樣品中還原糖含量，根據(jù)計(jì)算公式得到三者的還原糖含量分別為0.59%，0.88%，0.66%。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 在優(yōu)化條件下對(duì)晉黍7號(hào)樣品進(jìn)行測定，重復(fù)6次，得出平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差值和變異系數(shù)，考察方法的精密度。如表3所示，計(jì)算得到平均值為0.66%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.007 7，變異系數(shù)為0.011 7，可見該法用于還原糖測定具有較好的精密度[9-15]。

2.2.6 回收率試驗(yàn) 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在1 mL已知含量的樣品液中分別加入0.02，0.04，0.1 mg 0.1% 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，測定回收率，結(jié)果見表4。

回收率=（加標(biāo)測定值-試樣測定值）/加標(biāo)量×100%

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，GB/T 5513—2008中鐵氰化鉀法和3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法均適用于糜子中的還原糖含量測定。用鐵氰化鉀法測得晉黍1號(hào)、晉黍4號(hào)、晉黍7號(hào)中的還原糖含量分別為0.71%，0.8%，0.76%，滴定操作較為簡便，但準(zhǔn)確性較差。用DNS 法測得的含量值分別為0.59%，0.88%，0.66%，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.007 7，變異系數(shù)為0.011 7，回收率范圍85.0%～100%，DNS法測定還原糖含量穩(wěn)定性與準(zhǔn)確度高。

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