豬源沙門(mén)氏菌攜帶I類(lèi)整合子向人源細(xì)菌體外轉(zhuǎn)移的研究

王學(xué)君+盧春洪+王源+譚艾娟+呂世明+蔣慶慶+符東順

摘 要：為考察豬源沙門(mén)氏菌攜帶的I類(lèi)整合子向人源細(xì)菌在體外接合試驗(yàn)中的轉(zhuǎn)移頻率，在體外接合試驗(yàn)中應(yīng)用PCR方法檢測(cè)細(xì)菌間I類(lèi)整合子的轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明：人源沙門(mén)氏菌I類(lèi)整合子轉(zhuǎn)移效率在1.6×10-3 ～2.5×10-4 cfu·mL-1（供體菌）之間，人源大腸桿菌I類(lèi)整合子轉(zhuǎn)移效率在1.5×10-5 ～8.3×10-6 cfu·mL-1 （供體菌）之間，豬源沙門(mén)氏菌I類(lèi)整合子未轉(zhuǎn)移給人源金黃色葡萄球菌。因此，豬源沙門(mén)氏菌I類(lèi)整合子攜帶耐藥基因盒在體外可向人源革蘭氏陰性菌發(fā)生轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移頻率較高。

關(guān)鍵詞：沙門(mén)氏菌；體外接合試驗(yàn)； 整合子；轉(zhuǎn)移

中圖分類(lèi)號(hào)：R446.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.10.004

Abstract： To investigate the transfer frequency of class I integrons from swine Salmonella to human bacteria on the conjugation test in vitro， the transfertation of class I integrons between the strains was determined with PCR method. Results showed that the transfertation rate of class I integrons from swine Salmonella to human Escherichia coli were in 1.6×10-3 ～2.5×10-4 cfu·mL-1 （donor strain）， and to human Salmonella were 1.5×10-5 ～8.3×10-6 cfu·mL-1 （donor strain）. Class I integrons were no found in human in human Staphylococcus aureus. So， class I integrons of swine Salmonellae could transfer to gram-negative bacteria of human origin in vitro and the transfer frequency was quite high.

Key words：Salmonella； integron； transfer； conjugation test in vitro

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是全球公認(rèn)的主要?jiǎng)游镌醇?xì)菌傳染病，危害人和動(dòng)物健康的重要致病菌，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)和食品安全[1]。整合子是介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要機(jī)制之一[2]，同時(shí)整合子可定位于質(zhì)粒上，也可以作為轉(zhuǎn)座子的一部分參與轉(zhuǎn)移，使耐藥基因在細(xì)菌種間和種內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。整合子攜帶耐藥基因體外轉(zhuǎn)移多集中在臨床菌株的研究中[4]，但對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌的報(bào)道較少，且整合子攜帶耐藥基因盒在細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移，加快了臨床耐致病菌獲得耐藥性。本研究是將5株豬源沙門(mén)氏菌I類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株與人源性不攜帶I類(lèi)整合子的沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各1株進(jìn)行耐藥基因的體外轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，考察I類(lèi)整合子攜帶耐藥基因能否在人源、動(dòng)物源細(xì)菌間傳播，為細(xì)菌耐藥性的傳播監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 供體菌：豬源沙門(mén)氏菌5株，含有I類(lèi)整合子（貴州大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室保存）。

受體菌：人源大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌各1株（由貴陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)），且不攜帶I類(lèi)整合子及耐藥基因盒。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 LB肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、GN增菌液、木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鈉瓊脂培養(yǎng)基（XLD）、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、貝爾德-帕克氏瓊脂培養(yǎng)基（BP）均購(gòu)自杭州博微生物技術(shù)有限公司；四環(huán)素和鏈霉素購(gòu)自上海博微科技有限公司。Ex Taq酶試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外接合試驗(yàn) [5-7] 供、受體菌分別于LB肉湯中37 ℃過(guò)夜；調(diào)整菌液為2個(gè)麥?zhǔn)蠞舛龋魑?.1 mL加入0.8 mL LB肉湯，37 ℃孵育4 h；菌液3 800 r·min-1離心2 min，棄上清液，1 mL生理鹽水將沉淀混勻；吸取0.1 mL涂布于MHA平板，37 ℃過(guò)夜；經(jīng)102～103倍稀釋后吸取0.1 mL菌液涂布于含雙抗菌藥物（0.02 mg·mL-1四環(huán)素+0.05 mg·mL-1鏈霉素）的EMB、XLD、BP選擇性培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h；供體菌涂布于含單抗的XLD培養(yǎng)基上，受體菌涂布于單抗的EMB、XLD、BP平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2 接合頻率統(tǒng)計(jì) 供/受體菌進(jìn)行選擇性平板計(jì)數(shù)，當(dāng)供體菌和受體菌在雙抗選擇性培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)的情況下，計(jì)數(shù)接合菌、供受體菌數(shù)。接合頻率Fc （conjugation frequency）：Fc=T/R，T為耐藥性轉(zhuǎn)移接合子的平均菌落數(shù)，R為受體菌平均菌落數(shù)。

1.2.3 接合子中整合子陽(yáng)性菌株檢測(cè) 在不同抗性平板上隨機(jī)挑選 10 個(gè)單菌落，進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，陽(yáng)性菌株數(shù)為 I1，參照文獻(xiàn)[8]，以整合酶intI-F/intI-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游：5′-CGATGCGTGGAGACCGAAACCTT-3′，下游：5′-GTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGC-3′，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性300 s，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 S，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。產(chǎn)物采用2.0% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.4 體外I類(lèi)整合子轉(zhuǎn)移效率的測(cè)定 由整合子轉(zhuǎn)移效率公式計(jì)算，整合子轉(zhuǎn)移率 =I1/N*Fc，其中，I1/N為 PCR 陽(yáng)性率，M/D為接合效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外接合子篩選結(jié)果

從表1數(shù)據(jù)可知，5株豬源沙門(mén)氏菌與人源沙門(mén)氏菌的接合頻率在2.1×10-3～3.5×10-4之間；與人源大腸桿菌接合頻率在2.9×10-4～4.1×10-5之間；人源金黃色葡萄球菌接合頻率在2.3×10-7～5×10-8之間，且有兩株未檢測(cè)到接合子。

2.2 接合子中I類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株檢測(cè)結(jié)果

部分接合子中I類(lèi)整合子intI1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

由表2可知，5株人源沙門(mén)氏菌接合子中均檢測(cè)到I類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株，4株人源大腸桿菌接合子中檢測(cè)得到I類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株，人源金黃色葡萄球菌未檢測(cè)到I類(lèi)整合子。人源沙門(mén)氏菌接合子中檢測(cè)得到陽(yáng)性整合菌株明顯高于人源其他菌株，人源金黃色葡萄球菌接合子中未檢測(cè)到陽(yáng)性整合菌株。

2.3 體外I類(lèi)整合子轉(zhuǎn)移頻率結(jié)果

由表3可知，人源沙門(mén)氏菌I類(lèi)整合子轉(zhuǎn)移頻率在1.6×10-3 ～2.5×10-4 cfu·mL-1 （供體菌）之間，人源大腸桿菌I類(lèi)整合子轉(zhuǎn)移頻率在1.5×10-5 ～8.3×10-6 cfu·mL-1 （供體菌）之間，豬源沙門(mén)氏菌I類(lèi)整合子未轉(zhuǎn)移給人源金黃色葡萄球菌。說(shuō)明沙門(mén)氏菌同種屬之間轉(zhuǎn)移效率高于其他人源細(xì)菌，革蘭氏陰性菌之間整合子攜帶耐藥基因盒存在轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，革蘭氏陰性菌向陽(yáng)性菌之間水平轉(zhuǎn)移可能性極小。

3 結(jié)論與討論

研究動(dòng)物源性細(xì)菌整合子-基因盒系統(tǒng)介導(dǎo)的耐藥機(jī)制是控制細(xì)菌耐藥性傳播的根源途徑。本研究探討豬源沙門(mén)氏菌向人源不同菌種之間的水平轉(zhuǎn)移，從分子水平分析細(xì)菌耐藥性獲得及傳播方式，為我國(guó)動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥性傳遞研究積累基礎(chǔ)資料，為指導(dǎo)規(guī)模豬場(chǎng)合理選擇用藥、制定干預(yù)細(xì)菌多重耐藥的產(chǎn)生及傳播措施提供了理論依據(jù)。

通過(guò)體外轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)豬源沙門(mén)氏菌與人源細(xì)菌體外接合頻率在10-3～10-8之間，低于劉渠等[6]報(bào)道的接合頻率10-1～10-5，而本試驗(yàn)中沙門(mén)氏菌同菌屬細(xì)菌之間的體外接合頻率高于不同菌屬細(xì)菌之間的接合頻率。

由豬源沙門(mén)氏菌I類(lèi)整合子轉(zhuǎn)移頻率結(jié)果表明，整合子在人源沙門(mén)氏菌與人源大腸桿菌中存在轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移頻率1.6×10-3 ～8.3×10-6 cfu·mL-1 （供體菌）之間， 與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。但是人源金黃色葡萄球菌接合子中未檢測(cè)到I類(lèi)整合子，說(shuō)明豬源沙門(mén)氏菌中I類(lèi)整合子向人源革蘭氏陽(yáng)性菌之間體外轉(zhuǎn)移可能性極小。

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