浙江東部泥鰍染色體倍性檢測(cè)與核型分析

王雨辰等

摘 要：采集浙江東部5地泥鰍群體樣本，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)泥鰍染色體倍體，使用光學(xué)顯微鏡分析其核型，為其種質(zhì)分析提供參數(shù)；采用體內(nèi)注射植物血凝素（PHA）和秋水仙素，提取頭腎組織，采用空氣干燥制片法制作泥鰍染色體標(biāo)本。結(jié)果表明：浙江東部各水系的泥鰍均為二倍體，核型公式為2n=8m+6sm+36t，NF=64。

關(guān)鍵詞：泥鰍；染色體倍性；染色體核型；浙江東部

中圖分類(lèi)號(hào) S966.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）18-116-02

泥鰍隸屬鯉形目鰍科泥鰍屬，是廣泛分布于浙江省各水體的小型魚(yú)類(lèi)，也是鰍科魚(yú)類(lèi)中最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一種。經(jīng)過(guò)近幾年的人工養(yǎng)殖，泥鰍市場(chǎng)愈發(fā)成熟，銷(xiāo)售量穩(wěn)中有升；各地泥鰍親本來(lái)源也愈發(fā)復(fù)雜，各養(yǎng)殖場(chǎng)泥鰍親本混雜養(yǎng)殖規(guī)格差異較大。為了探索適合浙江省的泥鰍種質(zhì)資源，筆者采集了浙江省多地的泥鰍野生群體進(jìn)行倍性分析和核型檢測(cè)，為泥鰍進(jìn)一步育種工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 2012年9～10月，在浙江省東部的桐鄉(xiāng)石門(mén)鎮(zhèn)、寧波澥浦、臨海汛橋、瑞安龍湖鎮(zhèn)和溫州鰲江采集泥鰍樣本。泥鰍全長(zhǎng)122～198mm，體重7.04～37.96g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)試劑見(jiàn)表1。

表1 制作染色體標(biāo)本藥品

[藥品名＼&純度＼&銷(xiāo)售商＼&氯化鈉（NaCl）＼&分析純＼&天津市廣成化學(xué)試劑有限公司＼&氯化鉀（KCl）＼&分析純＼&天津市廣成化學(xué)試劑有限公司＼&無(wú)水甲醇＼&≥99.9%＼&天津市廣成化學(xué)試劑有限公司＼&秋水仙素＼&95%＼&生興生物技術(shù)（南京）有限公司＼&乙酸＼&36%＼&國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司＼&聚羥基脂肪酸脂（PHA）＼&＼&廣州醫(yī)藥工業(yè)研究所＼&Gimesa染液＼&＼&北京康倍斯科技有限公司＼&]

1.3 泥鰍暫養(yǎng) 將收集來(lái)的泥鰍經(jīng)10mg·L-1的聚維酮碘浸泡30min后暫養(yǎng)于120L水箱中，日投喂沉性顆粒飼料20g。

1.4 倍性檢測(cè) 每個(gè)樣本按采集數(shù)量進(jìn)行倍性檢測(cè)。將樣品采用100mg·L-1MS222麻醉后，用裝有抗凝劑的1mL注射器通過(guò)尾椎抽血的方法抽取泥鰍血液，通過(guò)PBS溶液稀釋至血細(xì)胞濃度為106個(gè)·mL-1，冰上保存待測(cè)。以實(shí)驗(yàn)已確認(rèn)的二倍體泥鰍血樣為內(nèi)參，經(jīng)DAPI染液染色，大鱗副泥鰍血樣∶待測(cè)組血樣∶DAPI=1∶1∶2，染色5min后，使用流式細(xì)胞儀（Cell Lab QuantaTMSC，Beckman Coulter）進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 染色體標(biāo)本提取 從各群體中各取10尾泥鰍進(jìn)行標(biāo)本提取。參考國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[1]。泥鰍按50μg·g-1劑量從腹腔注入植物血凝素（PHA）飼養(yǎng)于22～25℃45L的水箱中，24h后腹腔注射20μg·g-1秋水仙素，培養(yǎng)3h后，剪斷鰓部血管，將魚(yú)體倒掛，待血液不再流出后，解剖取頭腎。將頭腎置于裝有0.75%生理鹽水的1mL離心管中清洗，后取出頭腎轉(zhuǎn)入1mL離心管中滴入2滴0.75%生理鹽水，用研磨棒研磨過(guò)120目篩，取細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入5mL離心管中，離心（3 000r/min）5min后，吸去液體，加入75mmol·L-1KCl溶液4mL，用移液槍吹打后靜置30min，離心（3 000r/min）5min后，加入固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）4mL，吹打均勻后靜置固定，然后離心（3 000r/min）重復(fù)3次。最后加入4mL固定液吹打均勻。用滴管吸取懸液，懸空滴在冷凍玻片上，酒精燈加熱烘干，Giemsa染色，待常溫干燥后，鏡檢。

1.6 核型分析 在顯微鏡油鏡視野中選取50個(gè)染色體中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。染色體類(lèi)型按照Levan等[2]的標(biāo)準(zhǔn)確定。數(shù)據(jù)用Excel和SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 倍性鑒定 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采集到的泥鰍樣品均為二倍體，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)四倍體（表2、圖1）。

2.2 染色體核型分析 在油鏡下選取分散良好、形態(tài)清晰的分裂相進(jìn)行分析，選擇500個(gè)中期分裂相進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)圖2。如圖2所示，染色體數(shù)目為50的分裂相占79.2%，占大多數(shù)。

由圖3可知，泥鰍的50對(duì)染色體中，中部著絲點(diǎn)染色體（m）4對(duì)，亞中部著絲點(diǎn)染色體（sm）3對(duì)，端部著絲點(diǎn)染色體（t）18對(duì)。組型公司為2n=8m+6sm+36t，臂數(shù)（NF）：64。對(duì)泥鰍染色體進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié)論

3.1 泥鰍的倍性 目前在我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的泥鰍群體有二倍體、三倍體、四倍體和六倍體[3-6]，不同倍體的泥鰍混雜出現(xiàn)并無(wú)一定規(guī)律，目前的泥鰍不同倍體的發(fā)現(xiàn)均為通過(guò)實(shí)地采樣分析所得，暫無(wú)相關(guān)理論驗(yàn)證。通過(guò)采樣調(diào)查，尚未在浙江省東部發(fā)現(xiàn)多倍體泥鰍。

3.2 泥鰍核型與地理種群 有研究表明，泥鰍存在明顯的地理種群現(xiàn)象[7-9]，而有學(xué)者則認(rèn)為泥鰍屬區(qū)域性分布不明顯[10]。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)表明，浙江省東部各地泥鰍核型一致，從染色體核型分析上尚不能進(jìn)行有效的區(qū)分，需要進(jìn)一步的進(jìn)行染色體分析實(shí)驗(yàn)。

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