黃連生物堿的提取及抗腫瘤抑菌活性研究

文 / 麻 慧* 朱軍強(qiáng)（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050）

基金項(xiàng)目： 國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（GJFP2015014）

黃連生物堿的提取及抗腫瘤抑菌活性研究

文 / 麻 慧* 朱軍強(qiáng)（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050）

基金項(xiàng)目： 國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（GJFP2015014）

本實(shí)驗(yàn)通過醇水法提取黃連中總生物堿，優(yōu)化了其提取工藝，并研究了生物堿對(duì)腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌的活性的影響。在提取的過程中以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)為單因素來研究各因素對(duì)提取率的影響。在單因素驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取的最優(yōu)條件為：乙醇濃度75%、料液比1:15、提取時(shí)間1.5h、提取次數(shù)2次。分別采用M TT法和抑菌圈實(shí)驗(yàn)研究黃連總生物堿對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制性。結(jié)果表明，黃連總生物堿具有較強(qiáng)的抑制H epG2腫瘤細(xì)胞及細(xì)菌生長的特性。

黃連，生物堿，抗腫瘤，抑菌性

黃連為多年生草本植物，屬毛茛科黃連屬。黃連含有多種生物堿，具有清熱燥濕，瀉火解毒的作用[1]。黃連和鹽酸小 堿具有抗病原微生物、抗腹瀉、抗炎等藥理作用[2]。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了黃連中生物堿的提取工藝，并研究了生物堿對(duì)腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌生長的影響。

1、材料和方法

1.1 樣品材料

實(shí)驗(yàn)所用的樣品是由市購的黃連，將樣品粉碎后過40目篩，然后用于實(shí)驗(yàn)；大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌由生命學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；實(shí)驗(yàn)所用的腫瘤細(xì)胞是HepG2(人肝癌細(xì)胞)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品的配制

稱取鹽酸小 堿標(biāo)準(zhǔn)品5mg，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，以體積分?jǐn)?shù)95% 的乙醇為空白，在紫外光最大吸收波長345nm 處測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。得回歸方程為y=9.0286x-0.0005，R2=0.9999。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取粉碎后的黃連樣品0.5g，分別選擇乙醇體積、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)為單因素，確定最佳的提取條件。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

通過在單因素實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同因素的實(shí)驗(yàn)，分析各種參數(shù)對(duì)于提取率的影響，確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。對(duì)照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以影響總生物堿提取率的乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)為4個(gè)影響因素，許沛虎等[6]也通過這幾個(gè)因素優(yōu)選出最佳工藝。3個(gè)水平L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選最佳提取工藝。因素水平見下表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors of Orthogonal experiment

1.2.4 黃連總生物堿的抗腫瘤活性及抑菌性研究

采用M TT法測(cè)定黃連生物堿對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。實(shí)驗(yàn)所選菌株為金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌。

2、結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

通過單因素實(shí)驗(yàn)，分別獲得了不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、不同的料液比、不同提取時(shí)間、不同的提取次數(shù)對(duì)總生物堿提取率的影響，見圖1。

圖 1 各種因素對(duì)提取率的影響Figure 1 Effects on extraction rate

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表Table 2 Analysis of orthogonal experiment

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影響提取率的因素順序?yàn)镈>B>C>A，即提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間>乙醇濃度。最佳工藝為：乙醇濃度75%，料液比1:15，提取時(shí)間2h，提取次數(shù)3次。結(jié)合提取時(shí)間對(duì)提取的影響，實(shí)際提取工藝為：乙醇濃度75%，料液比1:15，提取時(shí)間1.5h，提取次數(shù)3次。

2.3 黃連生物堿的抗腫瘤活性的研究

抑制率的計(jì)算公式：

圖6 不同濃度生物堿對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用Figure 6 Inhibitory effect of different concentration alkaloids on tumor cells

2.4 生物堿的抑菌性

樣品中提取的總生物堿不同濃度溶液體外三種菌體的抑菌圈直徑（cm）如下表3

表3 三種菌體的抑菌圈直徑Table 3 Diameter of antibacterial circle of three bacteria

從表中的數(shù)據(jù)可以看出，總生物堿對(duì)三種菌體的抑制性強(qiáng)弱為：金黃色葡萄球菌＞枯草桿菌＞大腸桿菌。在濃度范圍為2-8m g/m L的范圍內(nèi)對(duì)細(xì)菌的生長有顯著的抑菌效果，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3、結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)主要通過對(duì)提取工藝中的四個(gè)主要對(duì)提取率有影響的因素的探究，確定提取生物堿的最優(yōu)條件為：乙醇濃度75%，料液比1:15，提取時(shí)間1.5h，提取次數(shù)3次。生物堿對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長有明顯的抑制效果，抑制性隨時(shí)間的增長而增強(qiáng)；生物堿對(duì)三種細(xì)菌的抑菌強(qiáng)弱為：金黃色葡萄球菌＞枯草桿菌＞大腸桿菌。

小 堿抗腫瘤作用具有很廣泛的應(yīng)用性[6]。但目前有關(guān)小 堿抗腫瘤作用的具體機(jī)制尚有許多地方不清楚，如小 堿對(duì)機(jī)體免疫功能、淋巴細(xì)胞活性的影響，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，到底是阻滯于G0/G1期還是G2/M期[7]。目前研究大多集中于體外研究，小 堿在體內(nèi)是否也會(huì)產(chǎn)生同樣的功效尚未見報(bào)道,小 堿的吸收、作用條件都要受機(jī)體內(nèi)環(huán)境的限制,有研究報(bào)道稱小 堿為季銨類化合物，口服不易吸收。因此，小 堿要在體內(nèi)達(dá)到體外實(shí)驗(yàn)要求的水平將很難。黃連作為清熱解毒中藥廣泛應(yīng)用于臨床,并且具有很好的療效,而要將小 堿開發(fā)為有效的抗腫瘤藥物將有待于進(jìn)一步研究。

[1] 王秀杰. 黃連的藥理研究及現(xiàn)代應(yīng)用[J]. 中國藥師, 2003,6(6): 370.

[2] 張利生. 小 堿臨床用途[J] . 中國藥物與臨床,2004 ,4 (1) :78.

[3] 孟珺,周學(xué)琴.紫外分光光度法測(cè)定連蒲雙清片中鹽酸小 堿的含量[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2004,17(1):51- 57.

[6]W u SN, Yu HS, J an CR, et al. Inhibitory effects of barberine on voltage - and calcium - activated potassium currents in hum an m yelom a cells[J]. Life Sci, 1998, 62 (25): 2283 - 2294

[7] Borg P J, Sitaram B R. Ion- pair extrction and liquid chromatography analysis of morphine in rat brain and plasm a. J Chromatogr Biomed Appl, 1993, 621 (2):165- 168.

Study on extraction process of alkaloids from Rhizoma chinensis and its antitumor activity

(Lanzhou University of Technology, College of life science and engineering, Gansu Lanzhou 730050, China)

Total alkaloids in Coptis chinensis were extracted by alcohol dehydration in this experiment. Extraction process was optimized and the effects of alkaloids on tumor cells and bacteria activity were studied. In the extraction process, the effects of factors on the extraction rate were studied by using ethanol concentration, solid-liquid ratio, extraction time and extraction frequency. Orthogonal experiment was used to optimize the extraction process. Results show ed that the optimum conditions were: ethanol concentration 75%, solid-liquid ratio 1:15, extraction time 1.5h, extraction times 2 times. The inhibition of Hep G2 tumor cells and Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were studied by MTT method and antibacterial circle test respectively. The results show ed that alkaloids of Coptis chinensis could inhibit the grow th of Hep G2 tum or cells and bacteria.

Coptis chinensis, alkaloids, antitum or, antibacterial activity