云南玉溪煙區(qū)煙草蚜蟲對植物源農(nóng)藥的敏感性及其解毒酶活力比較

達愛斯　溫麗娜　謝道燕　戴勛　田育天　夏玉珍　何成興　吳文偉　柴建萍　胡保文　王正旭　楊澤　羅雁婕　林莉

摘要：應(yīng)用噴霧法測定了采自云南省玉溪市新平縣新化鄉(xiāng)和峨山縣岔河鄉(xiāng)的煙草蚜蟲種群對6種植物源殺蟲劑的毒力，并比較了2個煙蚜種群的3種主要解毒代謝酶活力、乙酰膽堿酯酶活力。結(jié)果表明，峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜對植物源殺蟲劑的敏感性高于新平縣新化鄉(xiāng)的煙蚜，其中0.5%藜蘆堿可溶液劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑、1%苦皮藤素水乳劑、2%除蟲菊素水乳劑、除蟲菊浸膏對新平縣新化鄉(xiāng)和峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的毒力比分別為1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037；在高濃度處理下，6種植物源殺蟲劑對峨山縣岔河鄉(xiāng)、新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的室內(nèi)盆栽藥效存在顯著性差異；0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿小劑在濃度不低于1125mL/hm²時，可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑在濃度不低于2250mL/hm²時，可有效防治新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜；2個地區(qū)煙蚜的谷胱甘肽s一轉(zhuǎn)移酶比活力有顯著差異，而羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶、乙酰膽堿酯酶的比活力差異不顯著。由結(jié)果可知，云南省玉溪市峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對6種植物源殺蟲劑的敏感性存在顯著差異，但羧酸酯酶、P450單加氧酶和乙酰膽堿酯酶3種解毒酶差異不顯著，研究結(jié)果可為使用植物源殺蟲劑防治煙蚜提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：煙蚜；植物源殺蟲劑；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；羧酸酯酶；細胞色素P450單加氧酶；乙酰膽堿酯酶

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0137-04

煙蚜（Myzus persicae）別稱桃蚜，屬同翅目蚜科瘤蚜屬，是一種重要的煙草害蟲，也是煙草病毒病的傳播介體。煙蚜以刺吸式口器吸收煙株葉、莖、花等部位的汁液，使被害煙株生長遲緩、葉片薄，嚴重時葉片向背面卷縮、變形，煙葉組織被破壞，而且煙蚜分泌蜜露污染煙葉，烘烤后的煙葉缺乏光澤，容易破碎，嚴重影響產(chǎn)量和品質(zhì)?；瘜W(xué)防治是防治煙蚜的主要措施之一，然而長期使用化學(xué)防治，致使煙蚜的抗藥性不斷增強及再猖獗發(fā)生，且使煙葉農(nóng)藥殘留增加。因此，低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性的植物源殺蟲劑日益受到了國內(nèi)外的重視。

植物源殺蟲劑是植物與病蟲害的長期斗爭中產(chǎn)生的具有選擇性殺蟲、殺菌活性的一系列次生代謝物。植物源殺蟲劑具有選擇性，且對非靶標生物安全，能維護生態(tài)平衡，在自然界中更易降解而使其農(nóng)藥殘留的危害降低，對自然環(huán)境產(chǎn)生的影響較小。玉溪市是云南省具有悠久歷史的煙葉重要產(chǎn)區(qū)，也是種植規(guī)模最大的地、州、市級煙區(qū)之一，對煙草病蟲害的防治極為重視。本研究為篩選適于防治煙蚜的植物殺蟲劑，并明確峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的抗藥性及其對不同植物源殺蟲劑的敏感性，比較了0.5%藜蘆堿可溶液劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、除蟲菊浸膏6種植物源殺蟲劑對玉溪市新平縣新化鄉(xiāng)和峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的室內(nèi)毒力及其防治效果，并比較了2個煙區(qū)煙蚜解毒酶的比活力，以期對上述煙區(qū)使用植物源殺蟲劑防治煙蚜提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試蟲源新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜種群采自云南省玉溪市新平縣新化鄉(xiāng)大寨常委會的煙株上，峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜種群采白玉溪市峨山縣岔河鄉(xiāng)文山村委會的煙株上，這2個種群分別在室內(nèi)利用盆栽煙苗進行飼養(yǎng)及擴繁。

1.1.2供試藥劑0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑均由成都新朝陽作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)；0.3%苦參堿水劑由南通神雨綠色藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；除蟲菊素浸膏（乙醇浸出液）由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所提供。

1.1.3試驗試劑考馬斯亮藍（；250、細胞色素c、還原型谷胱甘肽，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；牛血清白蛋白，云科生物工程公司生產(chǎn)；3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），阿達瑪斯一貝塔公司生產(chǎn)；毒扁豆堿、堅固藍B鹽、1-氯-2，4-二硝基苯，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；乙酸-α-萘酯，海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；碘化硫代乙酰膽堿，CROSORGANICS公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1室內(nèi)毒力測定方法以及盆栽藥效試驗室內(nèi)毒力測定以及盆栽藥效試驗均采用噴霧法，在溫室內(nèi)盆栽煙苗，待其生長到4～5張葉片接人煙蚜，讓其自然擴繁到一定數(shù)量后，進行室內(nèi)毒力測定試驗；每個藥劑設(shè)置6個濃度，以清水為對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，各個重復(fù)隨機排列，用小型噴霧器對煙蚜蟲進行葉面噴霧防治，每個處理的總噴霧量為150mL藥液。每株煙苗隨機標記3張展開葉，并調(diào)查煙蚜數(shù)量；施藥24h后調(diào)查煙蚜活蟲數(shù)，統(tǒng)計分析其室內(nèi)毒力、防效。

1.2.2解毒酶比活力測定

1.2.2.1粗酶液制備及酶源蛋白質(zhì)含量的測定選取50頭煙蚜，加0.05mol/L、pH值7.5的Tris-HCl緩沖液1mL，冰浴研漿，離心（4℃，12000r/min）20min，取上清作為工作酶液。蛋白含量測定采用Bradford的方法，用考馬斯亮藍染色，以牛血清蛋白為標準蛋白。

1.2.2.2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）的測定

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對1-氯-2，4-二硝基苯的活性測定參照相關(guān)文獻并改進，每個處理樣品各設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)總體積為300mL，先分別加入100μL0.6mmol/LCDNB、100μL6mmol/L谷胱甘肽，混勻后在37℃條件下放置20min；然后加入100μ待測酶液（對照加入0.05mol/L、pH值7.5的Tris-HCl緩沖液）。利用酶標儀于37℃條件測定340nm下5min內(nèi)吸光度D340nm的變化，每個樣品均設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.2.3羧酸酯酶的測定

羧酸酯酶的活性測定參照并改進VanA@eren的方法，用α-萘酚制作標準曲線。每個處理樣品各設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)總體積為200mL，先分別加入10μL的0.3mmol/L底物、75μL酶液（對照加入0.04mol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液），混勻后在30℃條件下放置10min；然后加入顯色劑25μL，利用酶標儀于30℃條件測定600nm處的D600nm值，每個樣品均設(shè)置3個重復(fù)。根據(jù)制作的標準曲線和酶原蛋白含量的測定結(jié)果，將D600nm值換算成比活力。

1.2.2.4細胞色素P450單加氧酶的測定根據(jù)相關(guān)參考文獻報道的方法并進一步改進，以細胞色素c制作標準曲線。每個處理樣品各設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)總體積為325μL，先分別加入200μ的3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺、80μ磷酸鉀緩沖液（0.625mol/L，pH值7.2），然后加入20μL酶液（對照加入0.04mol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液），最后加入25μLH2O2，混勻后在室溫（25～27℃）放置2h。測定450nm處的D450bnm值，每個樣品均設(shè)置3個重復(fù)。根據(jù)制作的標準曲線和酶原蛋白含量的測定結(jié)果，將，D450nm值換算成比活力。

1.2.2.5

乙酰膽堿酯酶的測定參考Ellman等的方法并進一步改進。以碘代硫代乙酰膽堿（ATChI）為反應(yīng)底物、5，5'-二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑。每個處理樣品各設(shè)置3個重復(fù)，反應(yīng)總體積為300mL，先分別加入100μL10mmol/L的碘代硫代乙酰膽堿、100μL0.1mol/L磷酸緩沖液（pH值7.5）；再加入50μL酶液（對照加入0.1mol/L、pH值為7.5的PBS），混勻后在37℃條件下放置10min；再加入0.125mmol/L的DTNB，于37℃條件測定412nm處10min內(nèi)的D412nm變化值，每個樣品均設(shè)置3個重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

上述所有試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及方差分析均采用SPSS軟件（sPSS17.0）進行，毒力回歸式由機率值分析法計算得到，并采用Duncan's新復(fù)極差法和獨立樣本t檢驗比較各處理間的差異性。

2.結(jié)果與分析

2.16種植物源殺蟲劑對煙蚜的室內(nèi)毒力

采用噴霧法測定了6種植物源殺蟲劑對2個煙區(qū)煙蚜的室內(nèi)毒力。結(jié)果表明，峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜對藥劑敏感性高于新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對藥劑敏感性，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲菊浸膏對峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的半致死濃度（LC50）分別為2.356、6.632、5.640、2.592、1.642、15.053mg/L；6種藥劑對新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的半致死濃度LCso分別為4.288、509.615、11.927、2.736、3.115、482.249mh/L；6種藥劑對新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜與峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的毒力比分別為1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037（表1）。峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對不同藥劑的敏感性存在差異，其中對2%除蟲菊素水乳劑、除蟲菊浸膏的敏感性差異較大，可能是新平縣新化鄉(xiāng)使用菊酯類殺蟲劑防治而使煙蚜產(chǎn)生耐藥性所造成的。

2.26種植物源殺蟲劑對2個煙區(qū)煙蚜的盆栽藥效試驗

比較了6種植物源殺蟲劑對峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜藥后24h的盆栽藥效，防效結(jié)果見表2。由表2中結(jié)果可知，6種植物源殺蟲劑除了除蟲菊浸膏外，在4500mL²、2250mL/hm²的處理對峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的防治效果顯著高于對新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的防效（獨立樣本t檢驗，P<0.05）。在峨山縣岔河鄉(xiāng)，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑可有效防治煙蚜，其在相同濃度處理下的防效不存在顯著性差異（P<0.05，Duncan's新復(fù)極差測驗）；而對于新平縣新化鄉(xiāng)的煙蚜，僅有0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑的防效較高，4500mL/hm²濃度下其他部分藥劑的防效存在顯著差異。在2個煙區(qū)中，O.5%藜蘆堿可溶液劑相對于其他藥劑具有較好的防效，2.0%除蟲菊素水乳劑次之，1.0%苦皮藤素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲菊浸膏（乙醇浸出液）依次降低。此外，6種植物源殺蟲劑除了除蟲菊浸膏外，其在1125mL/hm²處理可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，與高濃度處理無顯著差異；對于新平縣新化鄉(xiāng)，其藥劑濃度大于2250mL/hm²處理的防治才與其他處理存在顯著性差異。因此，峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜對藥劑的敏感性明顯高于新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑在不低于1125mL/hm²的條件下可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑在不低于2250mL/hmμ²的條件下可有效防治新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜。

2.3峨山縣岔河鄉(xiāng)、新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜解毒酶活力比較

采用生化法比較了峨山縣岔河鄉(xiāng)、新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶、乙酰膽堿酯酶4種解毒酶的比活力，結(jié)果見表3?？梢钥闯?，岔河鄉(xiāng)、新化鄉(xiāng)煙蚜的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的比活力分別為0.7644、2.0724mmol/（μg·min）；羧酸酯酶的比活力分別為4.8230、6.4444mmol/（μg·min）；細胞色素P450單加氧酶的比活力分別為2.3563、4.0482EU/（μg·min）；乙酰膽堿酯酶的比活力分別為0.0166、0.0136mmol/（min·mg）。峨山縣岔河鄉(xiāng)與新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶、乙酰膽堿酯酶的活力比分別為2.7111、1.3362、1.7180、0.8193。因此，新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜除乙酰膽堿酯酶外其他3種解毒酶比活力均高于峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，但2個地區(qū)煙蚜除谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活力間差異顯著，其他3種解毒酶比活力無顯著性差異（獨立樣本t檢驗）。

3.結(jié)論與討論

本研究應(yīng)用噴霧法比較了分別采自云南省玉溪市峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)的煙蚜種群對6種植物源殺蟲劑的毒力和室內(nèi)防治效果，并比較了2個煙蚜種群的3種解毒酶和1個靶標酶的比活力。結(jié)果表明，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲菊浸膏對新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜與峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜的毒力比分別1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037，即新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對6種藥劑的敏感性低于對峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，其室內(nèi)毒力高于峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜毒力；而在高濃度處理下，室內(nèi)防效顯著低于峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜。新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶的比活力均高于峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，但羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶的比活力不存在顯著性差異，這可能是峨山縣岔河鄉(xiāng)、新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對藥劑的耐藥性差異不顯著所致。

新平縣新化鄉(xiāng)一直以來主要采用常規(guī)化學(xué)防治，使得當?shù)氐臒熝练N群對防控藥劑敏感性下降，室內(nèi)防控效果下降，解毒酶比活力增加。而峨山縣岔河鄉(xiāng)的田間煙蚜的施藥時間較短且次數(shù)較少，對藥劑比較敏感。6種植物源殺蟲劑中，新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對2.0%除蟲菊素水乳劑和擬除蟲菊膏的敏感性最低。0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑在不低于1125mL/hm²可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜，其在相同濃度處理下的防效不存在顯著性差異。0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑在不低于2250mL/hm²的條件下對新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜的防效較高，與其他藥劑存在顯著性差異。

綜上所述，云南省玉溪市峨山縣岔河鄉(xiāng)和新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜對0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲菊浸膏6種植物源殺蟲劑的敏感性存在不同的差異，除谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的比活力差異顯著外，其他3種解毒酶的比活力均無顯著差異。0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑在不低于1125mL/hm2的條件下可有效防治峨山縣岔河鄉(xiāng)煙蚜；0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑在不低于2250mL/hm²的條件下可有效防治新平縣新化鄉(xiāng)煙蚜。本研究結(jié)果可為在煙草上使用植物源殺蟲劑防治煙蚜提供科學(xué)依據(jù)。