21個(gè)日本牡丹品種DNA指紋圖譜構(gòu)建與EST—SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析

孫嘉磊等

摘要：采用EST-SSR標(biāo)記構(gòu)建中國(guó)常熟尚湖牡丹園引栽的21個(gè)日本牡丹品種DNA指紋圖譜并進(jìn)行遺傳多樣性分析。以篩選出的10對(duì)多態(tài)性高、穩(wěn)定性好且在染色體上分布均勻的引物作為核心引物，構(gòu)建日本牡丹21個(gè)品種DNA指紋圖譜，用NTSYS-PCV2.10軟件分析遺傳多樣性。結(jié)果表明，10對(duì)EST-SSR引物在21份材料中共擴(kuò)增出47個(gè)多態(tài)性基因型，平均每對(duì)引物擴(kuò)增4.7個(gè)，變幅1～11個(gè)；10對(duì)引物的多態(tài)性頻率（FP）平均值為0.522，變幅0227～0.950；篩選出的2對(duì)核心引物可以將21個(gè)牡丹品種完全區(qū)分，以遺傳相似系數(shù)0.55為閾值可將21個(gè)供試牡丹品種分成2類。由結(jié)果可知，EST-SSR標(biāo)記在供試牡丹品種間多態(tài)性差異較大，適合用于牡丹的DNA指紋圖譜的構(gòu)建。

關(guān)鍵詞：EST-SSR；DNA指紋圖譜；遺傳多樣性；牡丹品種

中圖分類號(hào)： S685.11文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0050-04

收稿日期：2014-09-21

基金項(xiàng)目：江蘇農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：BE2011445）；江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201310333032Y）；江蘇省蘇州市科技計(jì)劃（編號(hào)：SZS201102、SYN201110、SNG201323）；蘇州市吳江區(qū)科技計(jì)劃（編號(hào)：WN201311、WN201317）；江蘇省常熟市科技計(jì)劃（編號(hào)：CS201205）。

作者簡(jiǎn)介：孫嘉磊（1992—），男，江蘇太倉(cāng)人，研究方向?yàn)橹参镔Y源利用開(kāi)發(fā)。

通信作者：楊志剛，碩士，副教授，從事天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。Tel：（0512）52251562；E-mail：zhigangyang77@sina.cn。牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews.）花大色艷，花香襲人，有“國(guó)色天香”之美譽(yù)，深受人們喜愛(ài)。關(guān)于DNA指紋技術(shù)在牡丹品種鑒別上的應(yīng)用，前人做了很多研究。朱紅霞利用AFLP標(biāo)記對(duì)牡丹品種的分類進(jìn)行了初步探索[1]。Hosoki等利用RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)牡丹品種和野生牡丹品種的DNA序列進(jìn)行了嘗試性分析[2]。由于技術(shù)比較成熟，以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記成為當(dāng)前植物品種DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的首選標(biāo)記[3]。李保印利用SSR標(biāo)記技術(shù)研究中原牡丹品種初級(jí)核心種質(zhì)和遺傳多樣性，并建立了核心種質(zhì)[4]。王淼等研究討論了牡丹品種的SSR-PCR反應(yīng)條件[5]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以用來(lái)區(qū)分牡丹品種，這是不容爭(zhēng)辯的事實(shí)[6]，近年來(lái)EST（expressed sequence tages）發(fā)展十分迅速，而EST-SSR與其他鑒別途徑相比，是一種相對(duì)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的途徑[7]。Temnykh 等研究顯示，他們所發(fā)現(xiàn)的牡丹EST-SSR位點(diǎn)絕大多數(shù)都具有多態(tài)性潛能[8]。張艷麗等以6個(gè)滇牡丹不同花色類群DNA為模板，對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行了篩選[9]。

牡丹品種的起源地在中國(guó)，在中國(guó)牡丹園藝栽培不斷發(fā)展的同時(shí)，日本也早就開(kāi)始進(jìn)行牡丹園藝品種的雜交培育和引種工作，形成了具有地方特色的牡丹品種群[10]，而目前針對(duì)國(guó)內(nèi)引栽的日本品系牡丹開(kāi)展DNA指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用EST-SSR標(biāo)記構(gòu)建中國(guó)常熟尚湖牡丹園21份日本品系牡丹品種的DNA指紋圖譜并進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為牡丹品種DNA指紋鑒定提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1供試材料

21份牡丹品種為中國(guó)常熟尚湖牡丹園引栽的日本牡丹品種，詳見(jiàn)表1。

表1供試21份日本牡丹主栽品種概況

編號(hào)品種名稱花色編號(hào)品種名稱花色1島錦復(fù)色12島大臣紫2島輝紅13金晃黃3日暮紅14海黃黃4百花選紅15玉廉白5火鳥紅16連鶴白6花王深銀紅17黑龍錦墨紫7芳紀(jì)火紅18新扶桑白8新日月紅19八千代椿銀紅9紅輝獅子大紅20吉野川粉10花競(jìng)粉21紫晃粉11皇嘉門黑紫

1.2DNA提取

按照CTAB法提取牡丹基因組DNA，操作流程如下：（1）在研缽中加入100 mg牡丹葉片樣品和700 μL CTAB提取液，充分研磨；（2）轉(zhuǎn)移混合液至1.5 mL離心管中，65 ℃水浴 30 min，每隔5 min振蕩混勻；（3）取出離心管，冷卻到室溫后，于8 000 r/min離心2 min；（4）取出離心管，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入等體積三氯甲烷混勻，振蕩10 min；（5）12 000 r/min常溫離心10 min；（6）轉(zhuǎn)移上清液至1.5 mL離心管中，加等體積異丙醇，混勻后靜置10 min，于 12 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用70%～75%乙醇漂洗沉淀2次，在超凈工作臺(tái)上吹干；（7）加50 μL ddH2O，將沉淀DNA溶解后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物信息

以張艷麗等對(duì)滇牡丹不同花色類群開(kāi)發(fā)的10對(duì)EST-SSR引物[9]作為本研究的候選引物（表2），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）純化。

20 μL反應(yīng)液中包括10×PCR buffer、0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2+、50 ng DNA模版和 03 μmol/L EST-SSR引物。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物選用60 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，36 W電泳3 h。參考王鳳格等的快速銀染法[11]并稍加修改：50%乙醇、2.5%冰乙酸組成的固定液固定5 min；雙蒸水快速漂洗1次；0.2%AgNO3染色5 min；15% NaOH、0.4%甲醛組成的顯影液顯影；固定液定影。