高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定預(yù)混合飼料中維生素C、維生素B2及其磷酸鹽

索德成， 趙小陽， 李 蘭

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081）

維生素B2和維生素C是動(dòng)物維持生命和生產(chǎn)的重要物質(zhì)。由于大多數(shù)動(dòng)物不能自身合成，需要在飼料中添加以滿足其生長(zhǎng)需求。但由于受維生素C的穩(wěn)定性和維生素B2的溶解度限制，其磷酸鹽形式維生素C-2-磷酸酯（VCP）和維生素B2-5-磷酸鈉（VB2P）也在飼料中廣泛應(yīng)用（陳麗和孫宏民，2004；Powers，2003）。 目前維生素 C、維生素B2、VCP和VB2P的檢測(cè)主要采用酶解法、微生物法、熒光法、高效液相色譜法 （HPLC）（San José Rodriguez等，2012；賈彤和陳冰，2009；海沙爾·吐熱別克和塔依爾·斯馬依，2009）。酶解法需利用特定的磷酸酶將維生素B2磷酸鈉或維生素C磷酸酯轉(zhuǎn)化成維生素B2或維生素C后測(cè)定。但是磷酸酶價(jià)格昂貴，對(duì)于復(fù)雜的預(yù)混合飼料提取無法取得滿意的結(jié)果（賈彤和陳冰，2009）。熒光法操作復(fù)雜，抗干擾能力差，難以用于預(yù)混合飼料的測(cè)定。目前對(duì)維生素C、維生素B2、VCP、VB2P和其他類型水溶性維生素的檢測(cè)研究均采用高效液相色譜法，但同時(shí)分離維生素C、維生素B2、VCP和VB2P的方法還鮮見報(bào)道。本研究通過優(yōu)化色譜分離測(cè)定條件，建立了利用高效液相色譜同時(shí)分離維生素 C、維生素 B2、VCP和 VB2P的方法，并對(duì)其他類型水溶性維生素?zé)o明顯干擾。該方法可用于測(cè)定預(yù)混合飼料中維生素 C、維生素 B2、VCP和VB2P的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Aglient 1100型高效色譜儀配備二極管檢測(cè)器（美國安捷倫公司）；色譜柱：Zor-bax Eclipse Plus C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；維生素 C （含量大于99%）、維生素B2（含量大于98.7%）、三乙胺-維生素C-2-磷酸酯（含量大于99%，Dr.Ehrenstorfer公司）、維生素B2-5-磷酸鈉（含量大于93%，購自阿拉丁試劑有限公司）、四丁基硫酸氫銨（Sigma公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Mili-Q純化后的超純水 （＞18 MΩ）；其他試劑均為分析純；不含上述成分的預(yù)混合飼料由北京華羅飼料添加劑廠提供，其他類型預(yù)混合飼料從中國市場(chǎng)上收集。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取三乙胺-維生素C-2-磷酸酯、維生素B2-5-磷酸鈉50 mg，置于50 mL容量瓶中，加入1.5 mmol/L四丁基硫酸氫銨緩沖溶液80 mL，超聲溶解，用四丁基硫酸氫銨緩沖溶液定容，于0～4℃冰箱保存。稱取維生素B225 mg，置于250 mL容量瓶中，加入200 mL水和2 mL冰乙酸，100℃水浴煮沸至完全溶解，冷卻，用水定容至刻度，于0～4℃冰箱保存。維生素C現(xiàn)配現(xiàn)用，稱取維生素C 100 mg置于100 mL容量瓶中，加四丁基硫酸氫銨緩沖溶液超聲溶解，定容至刻度。

將標(biāo)準(zhǔn)貯備液用水稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理 維生素預(yù)混合飼料：精密稱取0.5～2 g（根據(jù)樣品中維生素的含量定）置于50 mL塑料管中，加入1.5 mmol/L四丁基硫酸氫銨緩沖溶液20 mL，超聲30 min，于5000 r/min離心5 min。取上層溶液。過0.45 μm濾膜，上液相色譜測(cè)定。

復(fù)合預(yù)混合飼料：精密稱取2～5 g（根據(jù)樣品中維生素的含量定）置于50 mL塑料管中，加入約100 mg乙二胺四乙酸鈉和1.5 mmol/L四丁基硫酸氫銨緩沖溶液20 mL，超聲30 min，于5000 r/min離心5 min。取上層溶液，過0.45 μm濾膜，上液相色譜測(cè)定。

液體預(yù)混合飼料：根據(jù)樣品中維生素的含量，稀釋處理后上液相色譜測(cè)定。

1.4 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱；流動(dòng)相A：1.5 mmol/L四丁基硫酸氫銨緩沖溶液（用三乙胺和乙酸溶液調(diào)節(jié)到3.0）；流動(dòng)相 B：甲醇；流速：1.0 mL/min；梯度淋洗：0 ～ 3 min 2%B；3～9 min 2%B ～40%B；9～15 min 2%B ～40%B；15～20 min 2%B。 柱溫：30℃；檢測(cè)模式：二極管檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm。如需單獨(dú)測(cè)定，維生素 C為 243 nm，VCP為 263 nm； 維生素 B2、VB2P為267 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇 海沙爾·吐熱別克等（2002）采用離子對(duì)試劑（戊烷磷酸鈉、己烷磷酸鈉和庚烷磷酸鈉）分離維生素，但離子對(duì)試劑會(huì)使維生素C和VCP共流出，無法獲得良好的分離效果。成志強(qiáng)等（2001）使用磷酸二氫鉀溶液和甲醇，采用梯度淋洗方法有效分離了維生素C和維生素B2等8種水溶性維生素，但是該方法無法有效地分離維生素B2、VB2P，并且在此條件下，VCP與其他維生素同時(shí)出峰。為了有效地分離，本實(shí)驗(yàn)最終選擇氫氧化四丁基銨作為緩沖液進(jìn)行分離。

2.1.2 氫氧化四丁基銨緩沖溶液濃度、pH對(duì)分離效果的影響 將色譜柱溫度設(shè)定在30℃，流速為1.0 mL/min， 分別以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L的氫氧化四丁基銨緩沖溶液與20%甲醇作為淋洗液，考察氫氧化四丁基銨淋洗液濃度變化對(duì)維生素C、維生素B2、VCP和VB2P的分離及峰形的影響。結(jié)果表明，VCP和VB2P的保留時(shí)間隨淋洗液中氫氧化四丁基銨濃度的增加而縮短，氫氧化四丁基銨濃度對(duì)維生素C、維生素B2的保留時(shí)間影響較小。同時(shí)，氫氧化四丁基銨淋洗液濃度對(duì)VCP的峰形影響很大，淋洗液濃度越高，VCP的峰形越寬，靈敏度變低，對(duì)其他物質(zhì)無明顯影響。綜合考慮分離度、分離時(shí)間、峰形，最終氫氧化四丁基銨的濃度選定為1.5 mmol/L。

同時(shí)研究了使用氫氧化四丁基銨緩沖溶液作為流動(dòng)相情況下，pH值對(duì)分離的影響。結(jié)果表明，pH值對(duì)維生素C和維生素B2保留時(shí)間影響較小，而對(duì)VCP和VB2P保留時(shí)間影響顯著。pH值增加時(shí)，VCP和VB2P保留時(shí)間變長(zhǎng)。當(dāng)pH=3時(shí)，4種水溶性維生素的色譜峰保留時(shí)間基本穩(wěn)定，且色譜峰均達(dá)較好分離。故確定流動(dòng)相中氫氧化四丁基銨緩沖液的pH值為3.0。

2.1.3 甲醇對(duì)分離效果的影響和梯度選擇 研究了氫氧化四丁基銨與甲醇不同組成比例下的洗脫狀況，結(jié)果表明，甲醇含量的變化對(duì)VCP的保留時(shí)間無明顯影響，但對(duì)維生素C、維生素B2、VB2P有較明顯的影響；隨著甲醇含量的降低，VB2P和維生素B2兩組的保留時(shí)間延長(zhǎng)，而且維生素B2的色譜峰有明顯的拖尾，對(duì)稱性較差。參考4種維生素色譜峰的峰形、與其他維生素分離度和色譜分析時(shí)間，確定了流動(dòng)相的梯度起始和結(jié)束時(shí)的組成比例以及線性梯度洗脫程序。最佳洗脫梯度見1.4。在此條件下，4種待測(cè)物與其他維生素分離良好，具體分離色譜圖見圖 1。

圖1 維生素C、維生素B2、VCP和VB2P與其他水溶性維生素分離色譜圖

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將4種維生素標(biāo)準(zhǔn)分別掃描200～400 nm的吸收光譜，結(jié)果維生素B2、VB2P的最大吸收波長(zhǎng)均為266 nm；維生素C、VCP為243 nm。為便于同時(shí)檢測(cè)，將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置在255 nm。如為了獲得更好的結(jié)果，可將各種待測(cè)物分別采用其最大波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 提取劑及提取方法的選擇 維生素易溶于水，常溫下比較穩(wěn)定，用水提取即可有較好的回收率，但為了保證與流動(dòng)相一致，采用1.5 mmol/L四丁基硫酸氫銨緩沖溶液作提取溶劑。復(fù)合預(yù)混合飼料含有大量的金屬離子，在處理過程中，加入乙二胺四乙酸（EDTA）作為掩蔽劑，可以有效地消除金屬離子干擾，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。確定了提取溶劑后，實(shí)驗(yàn)比較振蕩提取和超聲波提取對(duì)其的提取效率，結(jié)果兩種提取方法無明顯差異。為了節(jié)約時(shí)間，最終選用超聲處理。

液體預(yù)混合飼料成分較為簡(jiǎn)單，可以直接稀釋處理后上機(jī)測(cè)定。

2.3 方法性能

2.3.1 線性方程與檢測(cè)限、定量限 用儲(chǔ)備液配制濃度為1～100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)液相色譜檢測(cè)，以峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液終濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程相關(guān)系數(shù)見表1?？梢姌?biāo)準(zhǔn)溶液在1～100 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好。

選擇空白的預(yù)混合飼料樣品，以依次遞減的方式添加標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)樣，經(jīng)提取、凈化步驟后進(jìn)行儀器分離測(cè)定，根據(jù)3倍噪音的峰響應(yīng)值得出方法的檢測(cè)限。根據(jù)10倍噪音的峰響應(yīng)值，確定定量限。結(jié)果見表1。

表1 方法的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

2.3.2 回收率與精密度 為了考查方法，精密稱取2 g空白維生素預(yù)混合飼料和5 g空白復(fù)合預(yù)混合飼料樣品，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，每個(gè)樣品6個(gè)重復(fù)?；厥章屎途芏葴y(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，各種維生素回收率均大于80%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.0%～9.6%，證明該方法適用于預(yù)混合飼料中維生素C、維生素B2、VCP和VB2P含量的測(cè)定。

表2 不同預(yù)混合飼料的添加回收率（n=6）%

2.3.3 實(shí)際樣品檢測(cè) 應(yīng)用該方法對(duì)從市場(chǎng)上采集到的20份不同預(yù)混合飼料進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表3。其中某些只添加VCP和VB2P的預(yù)混合飼料中也檢測(cè)出了維生素C和維生素B2，主要原因是添加在預(yù)混合飼料中的VCP和VB2P原料在合成過程中存在殘留的副產(chǎn)物（維生素C和維生素B2）。部分預(yù)混合飼料測(cè)定結(jié)果比標(biāo)示值高，尤其是維生素C，其原因是生產(chǎn)廠家為了保證產(chǎn)品的質(zhì)量，考慮到維生素的穩(wěn)定性，一般會(huì)在生產(chǎn)過程中過量添加。

表3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了利用高效液相色譜同時(shí)分離維生素 C、維生素B2、VCP和 VB2P的方法，并對(duì)其他水溶性維生素?zé)o明顯干擾。具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、分離效果好和一次處理同時(shí)分析多種水溶性維生素的特點(diǎn)。適合于預(yù)混合飼料中維生素C、維生素B2、VCP和VB2P含量的測(cè)定。

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