紫外-微波復(fù)合誘變選育高產(chǎn)纖維素酶的Trichoderma asperelloides菌株

方 芳， 李相前， 趙玉萍， 孔 晶， 朱 春

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安 223003）

纖維素是植物經(jīng)光合作用合成的一種由許多葡萄糖基組成的大分子物質(zhì)，由于其結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜，而不利于纖維素的轉(zhuǎn)化利用（李忠玲，2011）。纖維素酶的水解作用是一種高效、徹底、無污染分解纖維素的理想途徑（侯麗麗，2010）。能產(chǎn)生纖維素酶的微生物有細(xì)菌及青霉、曲霉、木霉等真菌，其中木霉是纖維素酶的重要生產(chǎn)菌株，而Trichoderma asperelloides是從棘孢木霉中分出的新種，兩者形態(tài)學(xué)基本無區(qū)別，但分子序列標(biāo)記不同（Smith等，2013）。目前國(guó)內(nèi)尚未見該菌種產(chǎn)纖維素酶的文獻(xiàn)報(bào)道。Trichoderma asperelloides41245能較好地以秸稈、麩皮、豆渣等為底物生產(chǎn)纖維素酶，為了進(jìn)一步提高該菌株的產(chǎn)酶能力，本研究選用了紫外-微波復(fù)合處理對(duì)該菌株進(jìn)行誘變，并通過纖維素剛果紅平板初篩和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩試驗(yàn)，選育產(chǎn)酶活力較高的突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 菌種為Trichoderma asperelloides，購(gòu)于CICC，編號(hào)為41245。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌種保藏和活化培養(yǎng)基：6°Bé麥芽汁100 mL，纖維素粉2 g，瓊脂2 g。初篩培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC）10 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀 1 g，硫酸鎂0.5 g，酵母膏0.5 g，剛果紅 0.0334 g，瓊脂18.00 g，水1000 mL。固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩培養(yǎng)基：在250 mL三角瓶中加入麥秸3 g，麩皮2 g，1%硫酸銨11.25 mL，121℃滅菌 20 min，備用。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 將Trichoderma asperelloides接種到麥芽汁培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)5～7 d。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 將活化好的菌株用無菌水洗滌孢子，置于含玻璃珠的三角瓶中，在28℃、120 r/min搖床振蕩20 min，用4層滅菌擦鏡紙過濾振蕩液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板對(duì)濾液中孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整其濃度至106個(gè)/mL，保存在4℃冰箱備用。

1.2.3 菌種的誘變 紫外誘變：打開紫外線燈（18 W）預(yù)熱30 min，取5份制備好的5 mL孢子懸液于9 cm培養(yǎng)皿中，將其置于距離紫外燈24 cm（垂直距離）處的磁力攪拌器上照射1 min后，打開皿蓋，邊攪拌邊紫外誘變處理，分別照射2、4、6、8、10 min，誘變菌液在黑暗中4℃冷藏1.5 h后在紅燈下稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取0.1 mL涂布于麥芽汁培養(yǎng)基平板28℃避光培養(yǎng)2～3 d，計(jì)平板菌落數(shù)。根據(jù)對(duì)照平板上的菌落數(shù)，計(jì)算紫外誘變不同時(shí)間的致死率，繪制致死曲線（Qu等，2011）。

微波誘變：選取經(jīng)紫外誘變后產(chǎn)纖維素酶最高的突變株為出發(fā)菌株，選用功率700 W、額定微波頻率2450 MHz的微波爐，按不同的輻照時(shí)間10、30、60、90、120 s， 對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行輻照處理，每輻射10 s用冰水混合浴法消除微波熱效應(yīng)。然后稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取0.1 mL孢子懸液涂布于麥芽汁培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)對(duì)照平板上的菌落數(shù)，計(jì)算微波不同輻照時(shí)間的致死率，繪制致死曲線（賀小賢等，2011；蘭時(shí)樂等，2007）。

紫外和微波誘變的致死率公式為：

1.2.4 菌株的初篩 選擇致死率在70%～80%平板上的單菌落分別點(diǎn)種于纖維素剛果紅初篩培養(yǎng)基上，每個(gè)平板點(diǎn)3個(gè)點(diǎn)，于28℃培養(yǎng)96 h，挑選出Hc值 （單菌落的纖維素水解圈與菌落直徑之比）大于對(duì)照組的菌種，接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，備用。

1.2.5 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩 將對(duì)照菌株與初篩所得的菌株分別配制成菌濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液，以10%的接種量接種于固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩培養(yǎng)基中，混勻，于28℃恒溫培養(yǎng)96 h，測(cè)定纖維素酶活力。

纖維素酶粗酶液的制備：將發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基按照固液比為1∶10，置于30℃的120 r/min搖床浸提1 h，然后在4℃，3000 r/min離心 l5 min，上清液即為粗酶液。

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，包括內(nèi)切葡聚糖酶、外葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居“中等”的纖維性材料。濾紙酶法是以濾紙為底物經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖的量來表征纖維素酶系總的糖化能力的方法，此方法應(yīng)用廣泛，它反映了三類酶組分的協(xié)同作用，統(tǒng)稱濾紙酶活（FPA）（趙玉萍和楊娟，2006）。因此本試驗(yàn)用FPA代表纖維素酶活力。其測(cè)定方法為：在試管中加2 mL 0.1 mol/L、pH 4.6醋酸緩沖液，再加入1條1 cm×6 cm濾紙（50 mg±1 mg），50 ℃預(yù)熱 5 min 后在試管中加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃保溫 60 min，加入25 mL容量瓶中 （事先容量瓶中加入2 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑），在沸水浴5 min，流水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至刻度。同時(shí)用失活的酶作對(duì)照。在540 nm下測(cè)吸光度值，并從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的葡萄糖含量，折算成酶單位。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線參照王菁莎等（2005）繪制。

本試驗(yàn)中酶活單位定義為以濾紙為底物，在pH 4.6、50℃，恒溫 60 min條件下，以水解反應(yīng)中每分鐘催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)單位（U）。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性 將最終篩選得到的突變菌株在麥芽汁培養(yǎng)基斜面連續(xù)傳代5次，每轉(zhuǎn)接1次，同時(shí)接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)產(chǎn)酶試驗(yàn)，測(cè)定其FPA。

1.2.7 發(fā)酵過程中突變和對(duì)照菌株產(chǎn)纖維素酶的變化研究 將原始菌株和誘變獲得的高產(chǎn)纖維素酶的菌株分別配制成菌濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液，以10%的接種量接種于固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩培養(yǎng)基中，混勻，于28℃恒溫培養(yǎng)144 h，每隔24 h測(cè)定一次FPA。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變 從圖1可以看出，Trichoderma asperelloides41245孢子液經(jīng)紫外線照射后，在4 min內(nèi)隨著誘變時(shí)間的增加，致死率迅速上升。在4 min時(shí)致死率為78%，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率增加緩慢，在10 min時(shí)致死率已達(dá)到100%。賀小賢等（2011）、胡婷婷和邱雁臨（2008）研究表明，致死率在70%～80%的誘變劑量，正突變率較高。因此，確定紫外最佳誘變時(shí)長(zhǎng)為4 min。本試驗(yàn)選擇4 min作為誘變劑量進(jìn)行反復(fù)誘變，將其平板上的單菌落分別點(diǎn)種于初篩培養(yǎng)基上，篩選Hc值較原始菌株大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。纖維素水解圈的大小與纖維素酶活存在一定正相關(guān)性，因此選擇水解圈相對(duì)較大，即Hc值大的菌株為初篩菌株。本試驗(yàn)誘變篩選到8株Hc值較原始菌株大的菌株，分別編號(hào)為 ZW1、ZW2、ZW3、ZW4、ZW5、ZW6、ZW7、ZW8，其 Hc值見表 1。但梅煉等（2013）研究表明，Hc較大的菌落與其發(fā)酵酶活的正相關(guān)也不是完全絕對(duì)的，所以必須對(duì)初篩的菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩。從表1結(jié)果來看，也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，如ZW4和ZW6兩者Hc值相同，但發(fā)酵酶活存在差別；ZW7還出現(xiàn)了比原始菌株低的FPA。原因可能是平板厚薄不均、透明圈測(cè)定法不夠精確、突變株性狀不穩(wěn)定等（蘭時(shí)樂，2007）。從表1中的FPA及其變化率（相比于原始菌株）來看，ZW8的FPA最高，比原始菌株提高了28.09%，所以選取ZW8菌株作為下一輪誘變的出發(fā)菌株。

圖1 Trichoderma asperelloides41245菌株紫外誘變的致死率

表1 紫外誘變所得菌株的初篩和復(fù)篩結(jié)果

2.2 微波誘變 以紫外誘變獲得的ZW8菌株作為出發(fā)菌株，利用微波輻照，致死率與輻照時(shí)間的關(guān)系如圖2所示。隨著誘變時(shí)間的增加，致死率逐漸增大，在120 s時(shí)致死率達(dá)到100%，由此可見Trichoderma asperelloides菌株對(duì)微波輻照比較敏感。與紫外誘變一樣，選取致死率在70%～80%的誘變時(shí)間為最佳誘變時(shí)間，因此選取誘變60 s時(shí)（致死率為76%）平板上的菌株進(jìn)行后續(xù)的初篩。通過纖維素剛果紅平板初篩，篩選到4株Hc值較ZW8大的菌株，分別編號(hào)為ZWWB1、ZWWB2、ZWWB3、ZWWB4，并對(duì)這 4 株菌進(jìn)行固態(tài)產(chǎn)酶發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表2。通過微波誘變獲得的這4株菌其FPA與ZW8相比，均有不同程度的提高，其中ZWWB1較ZW8提高幅度大，達(dá)到41.33%。

圖2 Trichoderma asperelloides ZW8菌株微波誘變的致死率

表2 微波誘變所得菌株的初篩和復(fù)篩結(jié)果

2.3 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 部分經(jīng)人工誘變處理得到的高產(chǎn)突變菌株遺傳基因型不穩(wěn)定，易出現(xiàn)回復(fù)突變或產(chǎn)量下降等問題，故需要驗(yàn)證其遺傳穩(wěn)定性，一般連續(xù)傳代多次后產(chǎn)量不下降或下降不明顯的菌株遺傳穩(wěn)定性較好，適合用于以后的生產(chǎn)實(shí)踐。 對(duì)篩選得到的 ZWWB1菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，5次傳代測(cè)得的FPA結(jié)果見表3。從表3可以看出，經(jīng)5次傳代接種培養(yǎng)后，突變菌株的FPA變化不大。且從肉眼觀察菌體生長(zhǎng)情況、孢子大小、顏色等也均無變化。由此得出，Trichoderma asperelloidesZWWB1菌株遺傳性能穩(wěn)定，可以作為進(jìn)一步開發(fā)高活力纖維素酶的菌種。

表3 突變菌株ZWWB1遺傳穩(wěn)定性U/g

2.4 發(fā)酵過程中突變菌株和原始菌株的纖維素酶活性變化 將突變菌株和原始菌株接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔24 h定時(shí)取樣測(cè)定FPA，直到144 h發(fā)酵過程結(jié)束，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，突變菌株酶活明顯高于原始菌株，在發(fā)酵96 h時(shí)，突變菌株FPA是原始菌株的1.81倍。另外突變菌株與原始菌株的酶活變化趨勢(shì)基本相同，即在接種后的最初24 h，為菌株生長(zhǎng)的適應(yīng)期，接入的孢子開始萌發(fā)，此時(shí)產(chǎn)酶活力低，產(chǎn)酶量也比較少，培養(yǎng)時(shí)間在24～96 h時(shí)，F(xiàn)PA迅速升高，這是主要的產(chǎn)酶階段，但在96 h以后，F(xiàn)PA開始緩慢下降。因此，最佳的發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間是96 h。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)突變菌株與原始菌株產(chǎn)酶的影響

3 討論與結(jié)論

紫外誘變是一種傳統(tǒng)的誘變方法，具有方法簡(jiǎn)單、效果顯著的優(yōu)點(diǎn)，有報(bào)道表明紫外線與其他誘變劑進(jìn)行復(fù)合處理，可使紫外線的誘變效果得到提高（王智慧等，2013；曾慶梅等，2010）。 微波誘變是一種較新的誘變方法，它不需昂貴的設(shè)備、育種效果好、操作簡(jiǎn)單、安全、易推廣。因此本試驗(yàn)利用這兩種物理方法復(fù)合誘變，獲得一株產(chǎn)纖維素酶較高的菌株ZWWB1，在以麥秸和麩皮為基質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h，F(xiàn)PA達(dá)15.08 U/g，是原始菌株的1.81倍。傳5代FPA變化不大，說明該菌株遺傳性能穩(wěn)定。今后可進(jìn)一步優(yōu)化該菌的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件，或考慮利用基因工程手段改造以期進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶能力，使其在秸稈飼料發(fā)酵和纖維素酶生產(chǎn)中發(fā)揮更大的作用。

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