PPARγ轉(zhuǎn)錄阻遏NF-κβ通路抗體外循環(huán)肺損傷的影響及作用機制

楊 威 張小強 董 嘯

南昌大學第二附屬醫(yī)院心胸外科，江西 南昌 330008

體外循環(huán)心臟手術(shù)為外科常用治療方法，由于手術(shù)過程常合并全身炎癥反應和缺血再灌注損傷，往往引起肺功能下降，對術(shù)后患者疾病康復產(chǎn)生不利影響［1］。目前，關(guān)于體外循環(huán)肺保護的研究越來越受到關(guān)注，相關(guān)機制涉及白細胞反應、補體激活、氧自由基過量產(chǎn)生、細胞因子作用等［2］。

過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPARs)為核激素受體超家族成員。研究表明，PPARγ參與機體多種生理反應調(diào)節(jié)，尤其對炎性反應發(fā)揮了廣泛的調(diào)節(jié)作用，如降低活化氧釋放、減少細胞因子以及影響細胞的增殖分化和凋亡［3］。然而，關(guān)于PPARY在體外循環(huán) (CPB)術(shù)后肺損傷過程中如何變化鮮見報道。研究采取常規(guī)體循環(huán)肺損傷模型，以分析PPARγ在體外循環(huán)肺損傷中的作用及其機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型與分組 動物為成熟雄性昆明種大鼠，體外循環(huán)肺損傷大鼠模型由南昌大學心血管病研究所提供，體重250～300g。根據(jù)干預方式不同進行動物分組:對照組，大鼠只進行麻醉和CPB插管，不進行CPB轉(zhuǎn)流;模型組:大鼠進行30min深低溫停循環(huán);干預組:大鼠經(jīng)舌下靜脈注射0.3mg/kg PPAR-γ選擇性激動劑羅格列酮 (ROSI)30 min后，進行30min深低溫停循環(huán);以上每組動物10只。

1.2 組織標本采集 大鼠處死后取右肺固定于4%甲醛溶液中，梯度蔗糖溶液脫水，石蠟包埋，切片，片厚為4μm;組織經(jīng)脫蠟后，進行蘇木精和伊紅染色，鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)病理變化;取左肺分放于凍存管中，置于-80℃保存，以備下一步實驗測定。

1.3 Western blotting檢測 取出-80℃保存的左肺組織，提取組織總蛋白，蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳分離，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，封閉，再進行一抗、二抗處理，室溫脫色搖床避光處理1h，洗膜，熒光系統(tǒng)掃描，應用β-actin作內(nèi)參，記錄每個條帶灰度積分值;采取NIH Image圖像軟件分析各指標平均吸光度值 (average absorbance，AA)，對樣品積分值/內(nèi)參照積分值比值進行統(tǒng)計學處理;檢測包括PPAR-γ、NF-κβp65表達。

1.4 Elisa檢測 各組動物于造模后4h取外周血約5ml，3000r/min離心10min，儲于-80℃ 保存?zhèn)錅y，或直接在酶標儀上進行檢測，檢測指標有D-二聚體和熱休克蛋白70(HSP70)，試劑盒由北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司提供。

1.5 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料應用均數(shù)±標準差 (±s)表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用 χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PPARγ和 NF-κβp65蛋白表達比較 由表1可知，與對照組比較，模型組動物PPARγ表達有所增加，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)，而NF-κβp65表達明顯升高 (P＜0.01);ROSI預處理后，動物PPARγ表達較模型組明顯升高，而NF-κβp65表達明顯降低，比較差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)。

表1 ROSI預處理對體外循環(huán)肺損傷大鼠中PPARγ和NF-Bp65蛋白表達的影響 (±s)

表1 ROSI預處理對體外循環(huán)肺損傷大鼠中PPARγ和NF-Bp65蛋白表達的影響 (±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 PPARγ(灰度值) NF-κβp65(灰度值)對照組10 88.05±8.92 109.33±11.03模型組 10 89.72±8.67 262.51±26.85*干預組 10 119.21±7.87# 102.34±10.92#

2.2 D-二聚體和HSP70水平比較 由表2可知，與對照組比較，模型組動物血清D-二聚體水平明顯升高，而HSP70明顯降低 (P＜0.01);ROSI預處理后，動物血清D-二聚體水平較模型組明顯降低，而HSP70明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)。

表2 ROSI預處理對體外循環(huán)肺損傷大鼠血清D-二聚體和HSP70表達的影響 (±s)

表2 ROSI預處理對體外循環(huán)肺損傷大鼠血清D-二聚體和HSP70表達的影響 (±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與干預組比較，#P＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 D-二聚體 (mg/l) HSP70(ng/ml)對照組10 0.55±0.07 394.62±40.71模型組 10 2.79±0.28* 155.27±16.49*干預組 10 0.62±0.09# 386.55±39.75#

3 討論

CPB技術(shù)為心臟外科心內(nèi)直視手術(shù)開展的必需條件，故CPB術(shù)后必須面對肺功能損傷的并發(fā)癥，而如何預防和治療成為當前心外科急需解決的重要難題［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，肺缺血再灌注損傷和全身炎癥反應是CPB術(shù)后肺損傷的主要發(fā)生機制，該發(fā)現(xiàn)使并發(fā)癥的預防和治療得到明顯進步［6］。關(guān)于CPB術(shù)后肺損傷的分子機制的研究有利于新的治療方案以及防治藥物的開發(fā)，從而減少CPB術(shù)后肺功能損傷的發(fā)生。

PPARγ作為依賴配體活化轉(zhuǎn)錄因子的一種，也是調(diào)節(jié)炎癥反應的關(guān)鍵點;PPAR-γ可結(jié)合于多種核轉(zhuǎn)錄因子以及胞質(zhì)輔助蛋白，通過反式抑制作用，調(diào)節(jié)炎介質(zhì)合成和抗炎介質(zhì)產(chǎn)生，是維持細胞抗炎和促炎過程動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)點［7］。PPAR-γ由配體激活后對炎癥性疾病引起的炎癥反應起抑制作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κβ參與多種炎癥反應過程，可釋放多炎性介質(zhì)，是細胞核內(nèi)炎性介質(zhì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的啟動開關(guān)［9］。CPB術(shù)后肺功能損傷過程中炎癥反應是主要的危害物質(zhì)，且NF-κβ是多種疾病過程中肺損傷調(diào)節(jié)的重要因素［10］。因此，PPAR-γ激動劑可能經(jīng)抗炎途徑發(fā)揮保護肺損傷的作用。PPAR-γ對NF-κβ抑制作用明顯，具體途徑多條，如可直接結(jié)合NF-κβ亞基p65/p50，形成轉(zhuǎn)錄抑制復合物，降低NF-κβ與DNA結(jié)合活性，抑制NF-κβDNA合成，從而抑制其表達［11］。研究顯示，模型組動物NF-κβp65表達明顯升高;而采取PPAR-γ激動劑ROSI預處理后，動物PPARγ表達較模型組明顯升高，而NF-κβp65表達明顯降低，表明PPAR-γ被活化后，可能通過抑制NF-κβ途徑發(fā)揮對CPB術(shù)后肺損傷的保護作用。

研究證實，HSP70參與了PPAR-γ配體激活、對肺損傷有保護作用，且HSP70的抗炎作用與其減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、增強抗炎細胞因子水平、尤其是抑制NF-κB活性密切相關(guān)［12］。D-二聚體作為交聯(lián)纖維蛋白的最終降解產(chǎn)物，是凝血與纖溶功能的重要分子標志物。研究發(fā)現(xiàn)，多種疾病引起的肺損傷過程中，D-二聚體呈現(xiàn)高水平狀體，且D-二聚體與肺功能呈負相關(guān)［13］。研究結(jié)果顯示，模型組動物較對照組血清D-二聚體水平明顯升高，而HSP70明顯降低;ROSI預處理后，動物血清D-二聚體水平明顯降低，而HSP70明顯升高 (P＜0.01)。證實了PPAR-γ激動劑ROSI預處理可引起機體D-二聚體水平降低［14］。

綜上所述，PPARγ轉(zhuǎn)錄在CPB術(shù)后體外循環(huán)肺損傷中起到保護作用，其阻遏NF-κβ通路以及通過影響血清D-二聚體和HSP70水平可能在其中發(fā)揮了重要作用，值得進一步探究。

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