蛋制品中沙門氏菌的PCR及實時熒光PCR檢測方法

陳筱婷

（1,華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640；2，福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（福州）， 福建 福州 350000）

蛋制品中沙門氏菌的PCR及實時熒光PCR檢測方法

陳筱婷1,2

（1,華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640；2，福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（福州）， 福建 福州 350000）

研究針對蛋制品中沙門氏菌的檢測開發(fā)了一種快速靈敏的PCR檢測方法。研究方法采用煮沸法提取樣品DNA，運用PCR方法篩查樣品中的沙門氏菌基因成分。根據(jù)沙門氏菌基因組中的保守序列設(shè)計特異性引物與探針，PCR擴增結(jié)果表明，陽性樣品擴增獲得的序列與Genebank中沙門氏菌的基因序列完全匹配。采用實時PCR檢測方法可檢出濃度低至1.57×10-5μg . μL-1的沙門氏菌DNA，檢測時間少于24 h，對比常規(guī)的微生物培養(yǎng)方法，該方法顯著地提高了檢測速度。研究方法具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，可以廣泛應(yīng)用于蛋制品及相關(guān)食品中沙門氏菌的高通量篩查檢測。

蛋制品；沙門氏菌；食品；PCR；實時PCR

沙門氏菌(Salmonella)是一群寄生于人和動物腸道內(nèi)的無芽孢革蘭氏陰性直桿菌，其菌型繁多，分布廣泛，是一種重要的引起食源感染性腹瀉的致病微生物[1～6]。食品中沙門氏菌快速有效的檢測體系對于食品安全至關(guān)重要。蛋制品是一類重要的食品，在我國具有廣泛的消費市場，蛋制品在加工過程中容易遭受沙門氏菌的污染，從而帶來了一定的食品安全風險。從食品安全角度考慮，建立一種快速、靈敏、高效的蛋制品中沙門氏菌的檢測方法具有重大意義。

在我國，目前對沙門氏菌的檢測主要還依賴于傳統(tǒng)的微生物學檢測方法，該方法步驟繁瑣、費時費力，檢測過程一般需要3d的時間。為了適應(yīng)食品安全快速檢測趨勢與要求，急需開發(fā)一種快速篩查食品中沙門氏菌的檢測方法。

PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)的簡稱，是分子生物學中廣泛運用的一種技術(shù)，主要原理是通過熱循環(huán)，達到目的基因片段的大量擴增。目前這項技術(shù)越來越廣泛地運用于食品中致病菌的篩查檢測。目前在國際上已有較多PCR技術(shù)應(yīng)用于沙門氏菌檢測的研究報導[7～20]，相關(guān)研究表明，采用PCR方法進行樣品中沙門氏菌的檢測分析，具有高特異性、高靈敏度等特點。

為了節(jié)約檢測時間，提高檢測效率，該研究開發(fā)了蛋制品中沙門氏菌的PCR以及實時熒光PCR檢測方法。通過試驗比較，方法選用煮沸法提取樣品DNA，采用PCR技術(shù)檢測沙門氏菌。方法主要步驟包括使用培養(yǎng)基溶液預增菌，采用煮沸法提取DNA，運用PCR技術(shù)特異性地檢測沙門氏菌。

表1 引物信息以及擴增產(chǎn)物長度

實驗結(jié)果表明，應(yīng)用該研究方法可快速、準確、靈敏地檢測出蛋制品中的沙門氏菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株沙門氏菌(Salmonella)與陰性對照菌株大腸桿菌(Escherichia coli)等由福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院食品所微生物實驗室保藏。

1.1.2 蛋制品，部分購于市場，部分經(jīng)微生物方法檢測結(jié)果為陽性，于4 ℃冰箱中保存。

1.1.3 試劑：LB培養(yǎng)基，每升含有胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，pH 7.0)；TaKaRa rTaq(5 U.μL-1)、MgCl2(25 mmol . L-1)、dNTPs(10 mmol . L-1)、DL2000 DNA Marker、加樣緩沖液(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)、溴化乙淀、瓊脂糖、Qiagen Generation Capture Column Kit。

1.1.4 主要儀器：MJPCR基因擴增儀(PTC-200 DNA擴增儀)，Bio-Rad電泳儀，Bio-Rad UV凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad生物光學紫外分光光度計，Applied Biosystems 7300定量PCR檢測系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 預增菌：純菌培養(yǎng)所用試驗菌株接種于10 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)10 h (220 r.p.m . min-1)。蛋制品取1～3 g，加入液體LB培養(yǎng)基中，渦旋震蕩60 s，37℃培養(yǎng)10 h(220 r.p.m. min-1)。

預增菌后，分別取兩管3 mL菌液用于DNA提取。為了比較不同DNA提取方法應(yīng)用于沙門氏菌的提取效果，我們收集的一管菌液采用煮沸法提取DNA，另一管菌液采用Qiagen試劑盒進行提取。

1.2.2 PCR模板的制備方法

煮沸法提取DNA：取細菌培養(yǎng)液3.0 mL，置于小離心管中，8 000 r.p.m. min-1離心5 min。棄上清，沉淀用300 μL TE緩沖液懸浮，于95～98 ℃隔水煮沸15 min，10 000 r.p.m. min-1離心10 min。取上清，即為DNA模板溶液。

試劑盒法提取DNA：按照Qiagen試劑盒操作說明書進行DNA提取。

1.2.3 引物的合成

根據(jù)沙門氏菌基因組保守序列設(shè)計特異性引物，引物信息見表1，引物合成于Invitrogen公司。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系

常規(guī)PCR擴增采用Taq DNA聚合酶，反應(yīng)體系為25 μL體系，其中10×PCR buffer 2.5 μL、MgCl2 2.5 μL、dNTPs 1.0 μL、上、下游引物各0.5 μL、Taq酶0.3 μL，模板溶液2.0 μL、滅菌雙蒸水補足體積至25 μL。

常規(guī)PCR儀器反應(yīng)條件為94℃預變性5 min后，按94℃30 s、55℃1 min、72℃1 min，共進行35個循環(huán)，最后72℃ 延伸10 min，PCR產(chǎn)物于4℃保存。

實時PCR反應(yīng)體系：在25 μL反應(yīng)體系中，10×PCR buffer 2.5 μL、MgCl2 2.5 μL、dNTPs 1.0 μL、上、下游引物各0.5 μL、Taq酶0.3 μL，探針0.3 μL，模板溶液2.0 μL，滅菌雙蒸水補足體積至25 μL。

實時PCR反應(yīng)條件：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，53℃退火60 s。72 ℃延伸60 s。經(jīng)5個循環(huán)；94℃變性45 s，58 ℃退火60 s，72℃延伸60 s，經(jīng)35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃，10min。

1.2.5 靈敏度試驗

LB增菌培養(yǎng)液DNA提取用菌落平板記數(shù)法定量的菌液，加入5 mL液體LB培養(yǎng)基。于37℃、220 r.p.m. min-1的搖床中增菌培養(yǎng)10 h。吸取增菌液1 mL，用煮沸法制備PCR模板。

實時PCR檢測沙門氏菌的敏感性試驗用煮沸法提取沙門氏菌的基因組DNA作為模板溶液，測定基因組DNA濃度，將其梯度稀釋后進行實時PCR反應(yīng)，繪制各自的擴增曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋制品樣品中沙門氏菌的檢測結(jié)果

用合成的引物及PCR方法對20份蛋制品中的沙門氏菌進行PCR檢測分析。電泳結(jié)果如圖1所示，20份蛋制品中有12份蛋制品檢測出248 bp的沙門氏菌特異性基因片段，與預期基因片段長度相符。對于PCR檢測結(jié)果為陽性的樣品，采用國家標準方法驗證試驗結(jié)果，具體比對試驗結(jié)果見2.2。作為陰性對照的大腸桿菌樣品DNA未擴增出目標基因片段。試驗結(jié)果說明，引物的靈敏度及特異性較好，適合進行蛋制品中沙門氏菌的檢測。

圖1 蛋制品中沙門氏菌的檢測結(jié)果

2.2 PCR檢測方法與國家標準方法比對結(jié)果

對20份蛋制品中的沙門氏菌進行PCR檢測分析。電泳結(jié)果如圖1所示，20份蛋制品中有12份蛋制品檢測出248 bp的沙門氏菌特異性基因片段，與預期基因片段長度相符。對于PCR檢測結(jié)果為陽性的樣品，采用國家標準方法驗證試驗結(jié)果。作為陰性對照的大腸桿菌樣品DNA未擴增出目標基因片段。試驗結(jié)果說明，引物的靈敏度及特異性較好，適合進行蛋制品中沙門氏菌的檢測。

表2

2.3 方法靈敏度試驗

將純菌培養(yǎng)的沙門氏菌菌液按照煮沸法提取DNA，使用核酸蛋白測定儀測定核酸濃度，梯度倍比稀釋，使用實時熒光PCR儀進行檢測，確定沙門氏菌的檢測靈敏度，檢測結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示當基因組DNA含量為1.57×10-5μg/μL時，仍可被檢測出，說明實時PCR技術(shù)檢測沙門氏菌的靈敏度極高，且擴增曲線與模板DNA含量呈明顯相關(guān)性。

圖2 倍比稀釋的沙門氏菌菌液DNA的擴增曲線

3 討論

蛋制品是人民普遍喜愛的食品，它具有豐富的營養(yǎng)。蛋制品如果加工處理措施不當，容易帶入細菌，這對蛋制品的質(zhì)量安全檢測提出了更高的要求。蛋制品及相關(guān)食品中微生物的檢測一直是食品安全檢測重點，其中沙門氏菌由于具有較強的危害性，引起人們較多的關(guān)注。研究旨在建立一種能快速篩查檢測蛋制品中沙門氏菌的方法。

為了建立一種快速、靈敏、高效的蛋制品等食品中沙門氏菌的PCR檢測方法，模板DNA的制備是關(guān)鍵的一步。為此，我們對蛋制品中沙門氏菌模板DNA的制備方法進行了比較研究。分別采用煮沸法與試劑盒法制備沙門氏菌的DNA模板，上述兩種方法提取的沙門氏菌DNA經(jīng)PCR擴增后均能擴增出248 bp大小的特異性基因片段，說明煮沸法與試劑盒法均適用于蛋制品中沙門氏菌的檢測分析。試劑盒法由于使用成本較高，不適合于大量樣品中沙門氏菌的篩查與檢測分析。比較而言，煮沸法最為快捷、簡便易行，節(jié)省試劑消耗，且在試驗中可減少菌液和蛋制品中顆粒物質(zhì)對PCR的干擾。核酸擴增檢測以及DNA電泳結(jié)果均表明煮沸法提取得到的DNA濃度以及純度可以滿足檢測需求?？紤]到提取效率與提取時間，研究采用煮沸法提取蛋制品預增菌液中的DNA模板。

文章選擇沙門氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運操作子基因上的一段特異性序列合成引物與探針，擴增片段大小為248 bp，檢測結(jié)果顯示，引物與探針具有良好的靈敏性與特異性。通過優(yōu)化了的引物濃度、PCR反應(yīng)體系、退火溫度等條件，保證沙門氏菌PCR檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復性。

文章將PCR與實時PCR技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于蛋制品中沙門氏菌的檢測中。實時PCR技術(shù)檢測沙門氏菌的全過程在PCR管中得以完成，實現(xiàn)了檢測的定量和實時，省略了常規(guī)PCR的電泳步驟，同時避免了因電泳帶來的誤差。試驗中，定量PCR擴增曲線對于不同劑量的DNA模板，在1.57×10-1～1.57×10-5μg . μL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，即使樣品中模板濃度僅為1.57×10-5μg. μL-1依然可以被檢出。結(jié)果表明，實時PCR法對致病菌的實時定量檢測具有較好的應(yīng)用前景。當然，由于實時PCR需要特殊熒光染料試劑和昂貴的定量PCR儀器，給一些基層單位的檢測工作帶來困難。

研究建立的PCR方法只需經(jīng)過簡單的增菌即可以用煮沸法提取DNA進行檢測，簡便快捷，能在24小時之內(nèi)獲得擴增結(jié)果，大大縮短了沙門氏菌的檢測時間，特別適用于大量樣品中沙門氏菌的快速篩查檢測。文章將常規(guī)PCR與實時PCR技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于蛋制品中沙門氏菌的檢測中，建立了一整套從樣品預增菌到DNA提取到PCR檢測的方法，方法可推廣應(yīng)用于蛋制品及相關(guān)食品中沙門氏菌的快速高通量檢測中，具有較高的實用和推廣價值。

[1]CDC (2009) Multistate outbreak of Salmonella infections associated with peanut butter and peanut butter-containing products United States, 2008-2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 58, 85-90.

[2]Brenner, F.W., Villar, R.G., Angulo, F.J., Tauxe, R. and Swaminathan,B. (2000) Salmonella nomenclature. J Clin Microbiol38, 2465-2467.

[3]Mahajan, R.K., Khan, S.A., Chandel, D.S., Kumar, N., Hans,C. and Chaudhry, R. (2003) Fatal case of Salmonella enterica subsp. arizonae gastroenteritis in an infant with microcephaly. J Clin Microbiol 41, 5830-5832.

[4]Tatavarthy, A., Peak, K., Veguilla, W., Cutting, T., Harwood,V.J., Roberts, J., Amuso, P., Cattani, J. et al. (2009) An accelerated method for isolation of Salmonella enterica serotype Typhimurium from artificially contaminated foods, using a short preenrichment, immunomagnetic separation, and xylose-lysine-desoxycholate agar (6IX method). J Food Prot 72, 583-590.

[5]Nastasi, A., Mammina, C. and Salsa, L. (1999) Outbreak of Salmonella enteritis bongori 48:z35:- in Sicily. Euro Surveill 4, 97-98.

[6]Khoo, C.H., Cheah, Y.K., Lee, L.H., Sim, J.H., Salleh, N.A.,Sidik, S.M., Radu, S. and Sukardi, S. (2009) Virulotyping of Salmonella enterica subsp. enterica isolated from indigenous vegetables and poultry meat in Malaysia using multiplex-PCR. Antonie Van Leeuwenhoek 96, 441-457.

[7]Warren B R, Yuk H G, Schneider K R. Detection of Salmonella by flow through immunocapture real-time PCR in selected foods within 8 hours[J].J Food Prot.，2007,70(4)：1 002-1 006.

[8]石曉路，扈慶華，張佳峰，等. 多重實時PCR快速同時檢測沙門菌和志賀菌[J]. 中華流行病學雜志，2006，27(12)：1 053-1 056.

[9]Samantha Hu Liming，Arvind A Bhagwat.Application of a molecular beacon real-time PCR technology to detect Salmonella species contaminating fruits and vegetables[J].International Journal of Food Microbiology，2004，(95)：177-187.

[10]黃金林，焦新安，等. 應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)快速檢測沙門氏菌[J]. 揚州大學學報，2002，23(3)：5-7.

[11]Hatta M, Smits H L Detection of Salmonella typhi by nested polymerase chain reaction in Mood, urine and stool samples[J].Am J Trop Med Hyg，2007，76(1)：139-143.

[12]Trkov M.Avgustin G.An improved 16S rRNA based PCR method for the specific detection of Salmonella enteric[J].International Journal of Food Microbiology，2003，80(1)：67-75.

[13]Baumler, A.J., Heffron, F. and Reissbrodt, R. (1997) Rapid detection of Salmonella enterica with primers specific for iroB. J Clin Microbiol 35, 1224-1230.

[14]Cheng, C.M., Lin, W., Van, K.T., Phan, L., Tran, N.N. and Farmer, D. (2008) Rapid detection of Salmonella in foods using real-time PCR. J Food Prot 71, 2436-2441.

[15]Csordas, A.T., Barak, J.D. and Delwiche, M.J. (2004) Comparison of primers for the detection of Salmonella enterica serovars using real-time PCR. Lett Appl Microbiol 39,187-193.

[16]Gallegos-Robles, M.A., Morales-Loredo, A., Alvarez-Ojeda, G.,Osuna-Garcia, J.A., Martinez, I.O., Morales-Ramos,L.H.and Fratamico, P. (2009) PCR detection and microbiological isolation of Salmonella spp. from fresh beef and cantaloupes.J Food Sci 74, M37-M40.

[17]Kwang, J., Littledike, E.T. and Keen, J.E. (1996) Use of the polymerase chain reaction for Salmonella detection. Lett Appl Microbiol 22, 46-51.

[18]Moore, M.M. and Feist, M.D. (2007) Real-time PCR method for Salmonella spp. targeting the stn gene. J Appl Microbiol 102, 516-530.

[19]Rodriguez-Lazaro, D., Hernandez, M., Esteve, T., Hoorfar, J.and Pla, M. (2003) A rapid and direct real time PCR-based method for identification of Salmonella spp. J Microbiol Methods 54, 381-390.

[20]Ziemer, C.J. and Steadham, S.R. (2003) Evaluation of the specificity of Salmonella PCR primers using various intestinal bacterial species. Lett Appl Microbiol 37, 463-469.

10.3969/j.issn.1007-550X.2015-07-001

TS253.7

A

1007-550X(2015)07-0025-05

2015-06-15

陳筱婷，女，工程師，主要從事食品安全方面的研究。