抗褐化劑對荻外植體褐化和愈傷組織生長的影響

彭思佳 丁力 劉清波 陳智勇 肖亮 易自力 蔣建雄

摘要：以荻（Miscanthus sacchariflorus）幼穗和誘導出的愈傷組織為材料探討抗褐化劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸（Vc）、檸檬酸（CA）對外植體和愈傷組織抗褐化作用，以及愈傷誘導率及愈傷生長速度的影響。結(jié)果表明，3種抗褐化劑都能抑制外植體和愈傷組織褐化，并提高愈傷組織誘導率。添加0.2 g/L PVP時荻外植體的褐變程度最低，0.2 g/L CA時愈傷組織誘導率最高，為91.1%，向愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加0.2 g/L的Vc愈傷組織重量增加倍數(shù)最高，為21.38倍，且愈傷組織褐化率低為25.8%。

關鍵詞：荻；抗褐化劑；褐化；愈傷生長

中圖分類號：Q 946文獻標識碼：A文章編號：10095500（2015）05000706

收稿日期：20150423； 修回日期：20150510

基金項目：國家863計劃項目（2012AA10180104）資助

作者簡介：彭思佳（1990），女，土家族，湖南保靖人，在讀碩士研究生。

Email：psj0945@163.com

蔣建雄為通訊作者。

荻（Miscanthus sacchariflorus）系禾本科黍亞科芒屬多年生的C4植物，具有生長速度快、生物質(zhì)產(chǎn)量高、纖維品質(zhì)好、適應性廣等優(yōu)良特點[1]。荻主要分布于我國長江以北的廣大地區(qū)，野生資源數(shù)量及遺傳多樣性豐富。在北方干旱、半干旱地區(qū)，利用荻干物質(zhì)發(fā)展生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)具有廣闊的前景[2，3]。芒屬植物為高度自交不親和植物，有性繁殖后代個體間變異較大，因此，生產(chǎn)上荻的種苗繁殖主要采用扦插、分蔸等無性繁殖方式[4，5]，但是，這些無性繁殖方法的繁殖系數(shù)有限，育種緩慢[6]，滿足不了產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求，而植物組織培養(yǎng)技術不僅種苗繁殖系數(shù)大、可實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，并且也是進一步開展多倍體誘導和轉(zhuǎn)基因領域研究的基礎。

荻的外植體在離體培養(yǎng)過程中極易褐化，會影響愈傷組織的誘導和生長，嚴重時導致死亡。在植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象主要由酶促褐變引起[7]，目前已知過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）在酶促褐化過程中起主要作用，當組織中多酚氧化酶被激活，酚類物質(zhì)將被氧化形成褐色的醌類物質(zhì)[8，9]。在植物組織培養(yǎng)過程中通過采取措施，例如添加抗氧化劑、對外植體材料進行前處理和及時更換新鮮培養(yǎng)基等可以防止或減緩褐化現(xiàn)象，其中添加適宜的抗褐化劑既能抑制褐化也有利于愈傷組織生長[10]。試驗以荻幼穗和愈傷組織為試驗材料，研究不同抗褐化劑對荻愈傷組織誘導及繼代的影響，旨在篩選能提高愈傷組織誘導率和生長率的最佳抗褐化劑，以期建立高效的無性繁殖體系，為今后開展多倍體誘導、轉(zhuǎn)基因和體細胞誘變等遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新研究奠定基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料

試驗材料采自河北井陘的野生二倍體荻，現(xiàn)種植于湖南農(nóng)業(yè)大學芒屬植物資源圃，于秋季采荻孕穗期新鮮幼穗作為外植體。

1.2方法

1.2.1外植體的準備晴天上午10∶00取穎花原基形成期和花粉母細胞形成期（旗葉抽出長度2～3 cm時）大小一致的幼穗于4℃冰箱避光冷藏。24 h后取出幼穗，剝?nèi)ト~鞘和外層苞葉，保留旗葉。在無菌環(huán)境下用濃度為75%的酒精擦拭幼穗表面，再用0.1%（w/v）升汞滅菌15 min，最后用無菌水清洗4～5次[11-13]。

1.2.2培養(yǎng)基愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+2 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉。愈傷組織繼代培養(yǎng)基MS+2 mg/L 2，4D+0.1 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉，pH 5.8。在2種培養(yǎng)基中，分別添加過濾滅菌的3種抗褐化劑聚乙烯吡咯烷酮、抗壞血酸和檸檬酸（表1）。

表1試驗處理添加抗褐化劑類型及濃度

Table 1The types and concentrations of antioxidants

處理抗褐化劑類型濃度/g·L-1CK-01PVP0.22PVP0.63PVP1.04Vc0.15Vc0.26Vc0.47CA0.18CA0.29CA0.41.2.3愈傷組織誘導無菌環(huán)境剝離幼穗，將其切割成0.5 cm長短，并接入添加不同濃度的PVP，Vc或CA的愈傷誘導培養(yǎng)基中，使外植體盡量平鋪整個培養(yǎng)皿。每個處理重復3次，在25℃下暗培養(yǎng)。每隔5 d觀察記錄1次外植體褐化和愈傷誘導狀況，30 d統(tǒng)計愈傷組織誘導率。

1.2.4愈傷組織繼代培養(yǎng)將幼穗誘導出的愈傷組織在愈傷繼代培養(yǎng)基中按表1添加不濃度的PVP，Vc或CA，每個處理各接入10塊大小相對均勻的愈傷組織，并稱重，重復3次。每隔7 d稱重1次并觀察統(tǒng)計愈傷組織的褐化情況，培養(yǎng)35 d。

1.3統(tǒng)計分析

褐化程度采用目視法，褐化等級劃分為三級：

+ 外植體輕度褐化，周圍培養(yǎng)基色澤淺；

++ 外植體中度褐化，周圍培養(yǎng)基顏色加深；

+++ 外植體褐化嚴重，周圍培養(yǎng)基顏色深。

愈傷大小等級劃分為三級：

A 等級為愈傷組織直徑>0.5 cm；

B 等級為愈傷組織直徑>0.2 cm；

C 等級為愈傷組織直徑<0.2 cm。

誘導率= （愈傷個數(shù)/外植體數(shù)）×100%

褐化率=（褐化數(shù)/接種數(shù)）×100%

愈傷增長量=W1-W0

愈傷組織增長倍數(shù)=（W1-W0）/W0×100%

記接入繼代培養(yǎng)基時愈傷組織重量為W0，后期稱量重量為W1。

采用Excel 2007軟件和DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1愈傷組織生長曲線

在愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加0.2 g/L濃度的Vc可緩解愈傷褐化程度，并可增加愈傷組織的生長量（表2）。在最佳培養(yǎng)條件下，研究了荻愈傷組織的生長動力學（圖1）。愈傷組織生長不存在延滯期，接入培養(yǎng)基后，可快速進入增殖期以最快速度生長。21 d至28 d生長速率降低，直至35 d時所測鮮重低于28 d鮮重，此情況應該是愈傷組織出現(xiàn)衰老死亡。

圖1荻愈傷組織繼代培養(yǎng)的生長曲線

Fig.1Growth curve of Miscanthus sacchariflorus

calli during subculture2.2抗褐化劑對外植體褐化及愈傷組織誘導的影響

將幼穗接入添加抗褐化劑的誘導培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計外植體的褐化情況和愈傷組織的生長狀態(tài)（表2）。結(jié)果表明，在不添加任何抗氧化劑的培養(yǎng)基中，外植體褐化嚴重，切口處滲出褐色物質(zhì)使周圍培養(yǎng)基顏色改變并加深，誘導出的愈傷組織水漬化以褐色為主（圖2）。

添加PVP對外植體褐化具有緩解作用，外植體褐變程度降為中度和輕度。當PVP濃度從0.2 g/L增大至1.0 g/L，外植體褐變程度逐漸減弱且分泌的褐色物質(zhì)不斷減少；誘導出的愈傷組織為黃色和紫色的顆粒（圖2b，c），不同添加濃度下誘導出的愈傷組織大小與對照一致為C級。隨著添加量的增加，愈傷組織誘導率逐漸降低，添加濃度為0.2 g/L時，愈傷誘導率最大58.52%，增加至1.0 g/L時誘導率降低至23.7%，低于對照43.7%（圖3）。因此，0.2 g/L是荻圖2從荻幼穗誘導出的愈傷組織

Fig.2Calli induced from immature inflorescences

of M.sacchariflorus

注：a.褐色愈傷；b.黃色愈傷；c.紫色愈傷；d.淡黃色愈傷表2抗褐化劑下的外植體和愈傷組織狀態(tài)

Table 2Effect of different antioxidants on explants and callus

處理添加濃

度/g·L-1外植體褐

化程度愈傷顏色愈傷大小CK0+++黃、褐色CPVP0.2++紫、黃色CPVP0.6+紫、黃色CPVP1.0+紫、黃色BVc0.1++紫、黃色BVc0.2++黃、紫色BVc0.4++黃色BCA0.1+++黃、淡黃色BCA0.2+++黃、淡黃色ACA0.4+++A圖3不同PVP濃度下的誘導率

Fig.3Effect of different PVP concentrations

on callus induction rate愈傷組織誘導階段的最適PVP濃度。

在添加不同濃度Vc的處理中，外植體褐化程度都達中度，褐化程度低于對照，即Vc能增強外植體的抗褐化能力；在所有添加濃度下誘導出的愈傷組織大小均為B級黃色和紫色顆粒，且大于對照C級（表2）。愈傷組織誘導率隨著添加濃度從0.1到0.4 g/L增加不斷下降。濃度為0.1 g/L時愈傷組織誘導率最大84.44%，愈傷誘導率提高程度達極顯著（P<0.01，圖4）。

圖4不同抗壞血酸濃度下和誘導率的影響

Fig.4Effect of different Vc concentrations

on callus induction rate添加不同濃度的CA，外植體褐化程度均為嚴重，但褐化情況輕于對照。在添加濃度為0.2和0.4 g/L時愈傷組織的大小均為大顆粒A級，0.1 g/L時為B級大于對照C級。愈傷組織顏色以黃色和淡黃色為主（圖2b，c），濃度增大至0.4 g/L時有褐色愈傷組織（圖2a）出現(xiàn)。隨著CA添加濃度的增大愈傷組織誘導率先增大后減小。在0.2 g/L時愈傷組織誘導率最大91.11%，達極顯著提高（P<0.01），而在0.1 g/L時最小為51.11%大于對照43.7%。

圖5不同檸檬酸濃度對誘導率的影響

Fig.5Effect of different citric acid concentrations

on callus induction rate試驗結(jié)果可以看出添加不同抗褐化劑，荻外植體褐化程度強弱依次是CA >Vc> PVP；而獲得的愈傷組織顆粒大小是CA>Vc>PVP，愈傷組織最大誘導率大小為CA>Vc>PVP。

2.3抗褐化劑對愈傷組織生長量和褐化的影響

在愈傷組織繼代過程中向培養(yǎng)基中添加不同濃度的PVP，35后稱量愈傷組織重量，隨著添加濃度的增大，愈傷組織生長率不斷增大，PVP濃度為1.0 g/L時獲得的愈傷增長倍數(shù)最大 ， 最大倍數(shù)是9.43倍，愈傷褐化程度隨著PVP濃度的增加而減弱（表3）。

向培養(yǎng)基中添加不同濃度Vc，結(jié)果表明（表3）隨著添加濃度不斷增大，愈傷組織的重量增加倍數(shù)先增大后減小，最大增加21.38倍，而最小增加3.24倍。褐化率整體下降，褐化率隨著濃度的增加逐漸減小，最小褐化率25.2 %。因此，試驗設計濃度中0.2 g/L是Vc最適添加濃度，此濃度下愈傷組織的褐化程度下降為輕度，褐化率為25.8%。

由表3可知CA對愈傷組織繼代的影響隨著添加量增大愈傷組織重量增加倍數(shù)為先增大后減小，0.2 g/L時愈傷組織最重量增加倍數(shù)是9.54倍。愈傷組織褐化率的變化是隨著CA添加量增大褐化率先增大后減小。

表3不同抗褐化劑對荻愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

Table 3Effects of antioxidants treatment on Miscanthus

sacchariflorus callus subculture

抗褐化劑初始愈

傷量/g褐化

程度褐化

率/%愈傷組織

增長量/g增長

倍數(shù)CK0.53+++100.01.261.34PV（0.2）0.25++67.30.972.88PV（0.6）0.31++65.51.213.91PV（1.0）0.40+60.44.179.43Vc（0.1）0.14+30.62.3916.07Vc（0.2）0.13+25.82.9121.38Vc（0.4）0.29+25.20.942.24CA（0.1）0.37++30.11.462.95CA（0.2）0.24++56.72.539.54CA（0.4）0.24++49.51.374.713討論

褐化現(xiàn)象在芒屬植物組織培養(yǎng)過程中普遍存在。周樸華等[14]在南荻的無性系建立研究中報道繼代和分化過程中愈傷組織存在褐化死亡現(xiàn)象；周玥玥[15]研究五節(jié)芒時報道愈傷組織存在褐化情況；周娜[16]在建立芒轉(zhuǎn)基因體系研究中同樣報道芒愈傷組織存在褐化現(xiàn)象，并采取及時轉(zhuǎn)新鮮培養(yǎng)基的措施來緩解褐化；夏亞男等[10]研究了抗褐化劑對南荻外植體和愈傷誘導率的影響，指出PVP對外植體的抗褐化效果最好，檸檬酸能顯著提高愈傷組織誘導率但抗褐化效果不佳。本試驗研究了向培養(yǎng)基中添加PVP，抗壞血酸和檸檬酸對荻外植體褐化和荻愈傷組織生長的作用。

PVP是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，常用來吸附酚類物質(zhì)和保護細胞器。有研究認為它可以吸附酚類物質(zhì)，從而阻止酚類物質(zhì)被氧化為醌類物質(zhì)，使外植體褐化程度降低[17]。吳轉(zhuǎn)娣等[18]研究了愈傷組織誘導階段添加低濃度PVP能有效提高愈傷組織誘導率，本次試驗也表明在愈傷組織誘導階段低濃度PVP可以減輕荻外植體的褐化程度和提高愈傷組織誘導率，但高濃度PVP會降低愈傷誘導率，可能原因是PVP在吸附酚類物質(zhì)的同時對培養(yǎng)基中其他激素類物質(zhì)也有吸附[19]，而在愈傷組織繼代培養(yǎng)階段高濃度PVP卻能同時降低愈傷組織褐化程度和增加了愈傷組織生長量，有益于愈傷組織生長，此現(xiàn)象表明褐化在一定程度上會抑制愈傷組織的生長，同時也說明在繼代過程中愈傷組織對激素類物質(zhì)的依賴小于誘導過程。

CA具有酸性，將它添加到培養(yǎng)基中能夠通過抑制多酚氧化酶的活性來抑制褐化，但是其對外植體具有一定的損害作用[17]。本研究顯示在愈傷組織誘導階段它對荻外植體的抗褐化作用不明顯，卻能夠顯著提高愈傷組織誘導率，與PVP和Vc比較它是提高愈傷組織誘導率的最佳添加劑；在愈傷組織繼代階段，CA雖對愈傷組織具有抗褐化和增加愈傷組織生長量的作用，但與其他2種抗褐化劑比較效果并非最佳。因此，與另外2種抗褐化劑比較CA僅在愈傷組織誘導階段為提高愈傷組織誘導率的最佳抗褐化劑。

Vc具有還原性，不僅能夠在植物受傷時清除產(chǎn)生的自由基，還可以通過將多酚氧化酶中的Cu2+還原成Cu+從而減少酚類物質(zhì)的氧化達到減輕褐化的作用，因此在愈傷組織誘導過程中添加Vc能提高愈傷組織的誘導率[20，21]，此外還具有促進愈傷組織生長的作用[22]。試驗中，與其他2種抗褐化劑比較，Vc對荻愈傷組織誘導和愈傷組織生長的作用并不一致，在3種抗褐化劑中，添加Vc的最大愈傷組織誘導率居中，高于PVP，而低于CA，但在繼代過程中，添加Vc的愈傷組織生長速度明顯比添加另外兩種抗褐化劑的快，可能原因是較高濃度Vc能夠消除繼代培養(yǎng)基中更多的有害物質(zhì)且Vc對愈傷組織的毒害作用小。因此，在愈傷繼代過程中向培養(yǎng)基中添加Vc能獲得更大量的愈傷組織。

在愈傷組織誘導階段添加PVP荻外植體褐變程度最低，說明PVP對荻外植體的抗褐化作用最好，添加CA極顯著提高了愈傷組織誘導率，最大誘導率高于添加其他2種抗褐化劑的最大誘導率，因此，添加CA是最佳選擇；在愈傷組織繼代階段添加VC獲得的愈傷組織量最大是對照的21.38倍，以及褐化率低為25.8%，所以是繼代過程最佳褐化抑制劑，每一種抗褐化劑都在不同階段分別表現(xiàn)出優(yōu)勢，因此，在以后進一步研究中，可以考慮將多種不同抗褐化劑配合起來使用，以達到最佳的降低愈傷組織褐化和促進愈傷組織生長的效果。

綜合分析添加不同濃度PVP、檸檬酸和Vc對荻外植體的抗褐化作用及愈傷組織誘導的影響，向愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加0.2 g/L的檸檬酸是荻愈傷組織誘導階段的最佳選擇。在荻愈傷組織繼代過程中，培養(yǎng)基中添加0.2 g/L的抗壞血酸對愈傷組織抗褐化和促進愈傷組織生長的效果最佳。荻愈傷組織接入繼代培養(yǎng)基后不存在延滯期而是直接進入增殖期，28 d后停止增長，因此，繼代培養(yǎng)3～4周更換培養(yǎng)基有利于愈傷生長。

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