圣女櫻桃番茄再生體系的研究

趙新濤等

摘要： 以圣女櫻桃番茄為試材，通過對其子葉和下胚軸的離體培養(yǎng)，研究不同培養(yǎng)基和激素濃度及配比對愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化及生根誘導(dǎo)的影響，以篩選最佳再生體系，并研究VC對番茄組培過程中褐化現(xiàn)象的影響。結(jié)果表明：誘導(dǎo)圣女櫻桃番茄愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+（0.2～0.4）mg/L IAA+2.0 mg/L 6-BA，不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IAA+（1.0～3.0）mg/L 6-BA，誘導(dǎo)生根的最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA；子葉為最佳外植體，其不定芽的分化速度、分化率及生長情況均優(yōu)于下胚軸；在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加10 mg/L VC，能有效抑制褐化的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：圣女櫻桃番茄；子葉；下胚軸；再生體系；VC；褐化

中圖分類號：S641.204+.3文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2015）03-0013-05

Study on Regeneration System of Lycopersicon esculentum Mill.

Zhao Xintao， Su Feng*， Du Yanling

（Chemical Engineering College， Qingdao University of Science and Technology， Qingdao 266042， China）

AbstractThe effects of different culture medium， hormone concentration and ratio on callus induction， adventitious bud differentiation and root induction of Lycopersicon esculentum Mill. were studied by culturing cotyledon and hypocotyl in vitro. Vc was added in culture medium to control browning phenomenon. The results showed that the optimum medium and hormone ratio for callus induction was MS+（0.2～0.4） mg/L IAA+2.0 mg/L 6-BA； the optimum medium and hormone ratio for adventitious bud differentiation was MS+0.1 mg/L IAA+（1.0～3.0） mg/L 6-BA； the optimum medium and hormone ratio for root induction was 1/2MS+0.1 mg/L NAA. Cotyledon was the best explant， which showed higher differentiation speed and rate， and better bud growth condition than hypocotyl. The browning phenomenon could be controlled through adding 10 mg/L Vc in callus induction medium.

Key wordsLycopersicon esculentum Mill.；Cotyledon； Hypocotyl；Regeneration system；VC；Browning

圣女櫻桃番茄（Lycopersicon esculentum Mill.），又稱圣女果，茄科番茄屬[1]。圣女果中含有谷胱甘肽和番茄紅素，可促進(jìn)人體生長發(fā)育，增加抵抗力，而且維生素含量是普通番茄的1.7倍，尤其是維生素PP含量居果蔬之首，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為優(yōu)先推廣的“四大水果”之一。近年來，組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于番茄育苗生產(chǎn)、雜交、品種改良以及基因工程等研究工作。激素在植物再生體系建立過程中的作用不容忽視，在未添加激素的培養(yǎng)基中很難分化出不定芽或不定芽的分化率很低[2，3]。趙燕等[4]對雜交番茄早豐（07-13）的研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)番茄愈傷組織形成和芽分化的最佳培養(yǎng)基分別為MS+0.3 mg/L IAA+2.0 mg/L 6-BA和MS+0.1 mg/L IAA+2.0 mg/L 6-BA。仇燕等[5]對砧木1號番茄的研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)子葉外植體愈傷組織和不定芽的最適培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L IAA +1.0 mg/L 6-BA；誘導(dǎo)下胚軸外植體愈傷組織和不定芽的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L IAA +1.0 mg/L 6-BA。宗憲春等[6]對潘那利番茄生根條件的研究表明，0.1 mg/L IAA最利于生根。許飛云等[7]對黑珍珠番茄的研究表明，當(dāng)NAA濃度為0.05～0.08 mg/L時最利于生根。因此，不同品種番茄再生植株的獲得，對激素濃度、配比和培養(yǎng)條件等的要求也各不相同，需要進(jìn)行針對性的試驗，才能明確某一品種的激素要求，從而獲得質(zhì)量好、生長快的再生植株[8～10]。

褐化現(xiàn)象是植物組培過程中常見的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和再分化。愈傷組織褐變的機(jī)理是細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響而死亡，或細(xì)胞發(fā)生自然死亡時，其傷口分泌的酚類物質(zhì)在多酚氧化酶作用下氧化為醌類物質(zhì)造成的[11]。多項研究表明，在培養(yǎng)基中加入吸附劑活性炭或抗氧化劑VC，可有效遏制褐變的產(chǎn)生[12～14]。但活性炭在吸附有害物質(zhì)的同時也吸收了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，對愈傷組織的生長造成影響[15]。

本試驗以圣女櫻桃番茄為試材，以子葉和下胚軸為外植體，以篩選出最佳外植體類型；向培養(yǎng)基中添加不同濃度及配比的吲哚乙酸（indole-3-aceticacid，IAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-enzyladenind，6-BA）和2-（1-萘基）乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA），以篩選出愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化及生根誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基；向培養(yǎng)基中添加不同濃度的抗氧化劑VC，以篩選出抑制褐化的最適VC添加量，以期為番茄大家族再生體系的研究提供參考和依據(jù)。endprint

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗品種圣女櫻桃番茄，種子產(chǎn)于山東省德州市華信種業(yè)。

1.1.2培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基：1/2MS培養(yǎng)基（在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，大量元素減半，其它成分不變）。

愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng)基：以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L）、6-BA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L）。

生根培養(yǎng)基：以MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的單一激素IAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L）、NAA（0、0.05、0.1、0.3、0.5 mg/L）。

以上培養(yǎng)基均含3%蔗糖，添加0.7%瓊脂，調(diào)整pH值為 5.8～6.2。

1.2試驗方法

1.2.1無菌苗的獲得選取籽粒飽滿、大小一致的種子，清水浸泡6 h。待種子完全吸漲后，用75%的乙醇消毒30～60 s，無菌水沖洗3次；NaClO消毒15 min，無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干，接種于1/2MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，至大多數(shù)種子發(fā)芽露白，將其放置于溫度為26～28℃、光周期為16 h/d、光照強(qiáng)度1 800 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6～8 d獲得無菌苗。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽的分化取生長6～8 d的無菌苗，分別以子葉和下胚軸為外植體，將子葉切成約0.5 cm×0.5 cm的小塊，葉背向下平鋪接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；將下胚軸切成1 cm左右小段，接種于上述培養(yǎng)基中。每個培養(yǎng)皿接種10個外植體，先進(jìn)行暗培養(yǎng)，以誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生；然后進(jìn)行光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)生成不定芽，每隔10 d左右繼代一次，觀察并記錄試驗結(jié)果[16～18]。

1.2.3生根誘導(dǎo)當(dāng)不定芽長至2～4 cm左右時，自芽基部切下，接種于生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。統(tǒng)計并記錄根發(fā)生的時間及生長狀況。

1.2.4VC對褐化現(xiàn)象的抑制作用以篩選出的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在次代培養(yǎng)時添加不同濃度 VC（0、10、30、50 mg/L）。觀察褐化發(fā)生的情況，篩選出VC的最佳添加量。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

發(fā)芽率（%）=（發(fā)芽種子數(shù)/接種種子數(shù)）×100

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

不定芽的誘導(dǎo)率（%）=（分化出不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2結(jié)果與分析

2.1外植體的篩選

以子葉和下胚軸為外植體時圣女櫻桃番茄愈傷組織的發(fā)生時間不同，子葉接種8 d時切口處開始卷起膨大，出現(xiàn)大量綠色胚狀體，愈傷組織開始形成（圖1 A1）；下胚軸切段接種6 d時腫脹，兩端形成肉眼可見的愈傷組織（圖1 B1）。經(jīng)過2～3周的培養(yǎng)，兩種外植體均形成大塊的愈傷組織（圖1 A2、B2）。雖然以下胚軸為外植體的愈傷組織發(fā)生時間較早，但以子葉為外植體所形成的愈傷組織飽滿，且在愈傷發(fā)展過程中伴有不定芽的分化。

在不定芽的誘導(dǎo)過程中，同種激素條件下，子葉外植體的愈傷組織分化出不定芽的時間較短，且出芽率明顯高于下胚軸，形成的不定芽生長健壯且生長速度快。綜合比較，子葉為圣女櫻桃番茄組織培養(yǎng)的最佳外植體。

A1：子葉愈傷組織開始形成；A2：已成型的子葉愈傷組織；

B1：下胚軸愈傷組織開始形成；B2：已成型的下胚軸愈傷組織

2.2激素濃度及配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，試驗采用的25種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)番茄子葉和下胚軸形成愈傷組織，且出愈率較高，說明圣女櫻桃番茄的子葉和下胚軸均具有較強(qiáng)的脫分化能力，且對IAA和6-BA的濃度及配比要求不嚴(yán)格。比較可得，MS+（0.2～0.4）mg/L IAA+2 mg/L 6-BA培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織體積較大，結(jié)構(gòu)致密，生長速度快，適宜愈傷組織誘導(dǎo)。

2.3激素濃度及配比對不定芽誘導(dǎo)的影響

在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，愈傷組織可分化出不定芽，兩周后，長成有莖葉的苗（圖2）。20 d后，統(tǒng)計不定芽的分化情況。

由表1可以看出，不同濃度及配比的IAA、6-BA對不定芽的形成存在明顯差異：當(dāng)IAA濃度為0.1 mg/L、6-BA濃度為1.0～3.0 mg/L時，子葉和下胚軸來源的愈傷組織形成的不定芽誘導(dǎo)率較高，均達(dá)80%以上，且誘導(dǎo)時間最短，生長較快。隨著IAA和6-BA濃度的升高，雖然產(chǎn)生不定芽的時間和誘導(dǎo)率無顯著變化，但芽體生長緩慢，畸形芽比例升高。因此，適宜愈傷組織分化不定芽的培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IAA+（1～3）mg/L 6-BA，在該培養(yǎng)基中不定芽健壯、數(shù)目較多且長，生長迅速。

2.4激素濃度及配比對不定芽生根誘導(dǎo)的影響

當(dāng)不定芽長至2～4 cm時，將其切下放入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)（表2、3）。

由表2可以看出，當(dāng)IAA濃度為0.1～0.4 mg/L時，隨著IAA濃度的增加，根的數(shù)量增加，根系也變得粗壯；當(dāng)IAA濃度大于0.4 mg/L時，根的數(shù)量反而減少，而且長度也變短，這一現(xiàn)象在MS或1/2MS培養(yǎng)基中表現(xiàn)相同。因此， MS+0.3 mg/L IAA或1/2MS+0.3 mg/L IAA培養(yǎng)基的生根效果最好（如圖3A、B）。

由表3可以看出，在未添加激素的MS或1/2MS 培養(yǎng)基上時，不定芽在較短時間內(nèi)開始生根，說明不定芽的生長過程中會產(chǎn)生促進(jìn)生根的激素，這與王傲雪等[19]的研究結(jié)果一致；但生根細(xì)而長，長勢較弱，說明該培養(yǎng)環(huán)境不適合圣女櫻桃番茄生根。當(dāng)在MS或1/2MS培養(yǎng)基中添加NAA后，隨著NAA濃度的增加，生根數(shù)量先增加后減少，NAA濃度為0.10 mg/L時，生根數(shù)最多，根系粗而長并伴有須根；繼續(xù)增加NAA濃度，根雖變得更加粗壯，但長度變短且生根數(shù)量減少（圖3C、D）。NAA濃度相同時，1/2MS培養(yǎng)基上不定芽的根生長相對較好。因此，1/2MS+0.10 mg/L NAA培養(yǎng)基為最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。endprint

2.5VC濃度對抑制愈傷組織褐化的影響

本試驗以MS+0.3 mg/L IAA +2.0 mg/L 6-BA為培養(yǎng)基，添加不同濃度VC進(jìn)行愈傷組織的褐化抑制試驗。結(jié)果（表4）顯示，當(dāng)VC濃度為0～10 mg/L時，愈傷組織的褐化率從60%下降至10%，有效抑制了褐化現(xiàn)象的發(fā)生；當(dāng)VC濃度增大至10～50 mg/L時，褐化率由10%增至30%。分析原因可能是過量的VC對愈傷組織產(chǎn)生一定的干擾和毒害作用[11]：首先VC為酸性，大量的酸性物質(zhì)加入培養(yǎng)基中，破壞了愈傷組織生長環(huán)境中的酸堿平衡，使愈傷組織的生長受到影響，再次出現(xiàn)褐化；其次，VC雖為抗氧化劑，但過多外源性抗氧化劑的加入，也會破壞愈傷組織生長發(fā)育所需要的內(nèi)環(huán)境，打亂愈傷組織原有的代謝節(jié)律，從而造成愈傷組織發(fā)育不良。

3結(jié)論與討論

不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽分化的能力不同。本試驗中，以子葉為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的效率明顯高于以下胚軸為外植體的愈傷組織，且不定芽的分化系數(shù)高，芽體生長快，畸形芽率低[10， 21， 22]。因此，子葉為圣女櫻桃番茄組培的最佳外植體。

IAA和6-BA是植物愈傷組織和不定芽形成的常用激素。本試驗以圣女櫻桃番茄的子葉為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率都達(dá)到100%；以下胚軸為外植體時略低，但均在89%以上。在MS+（0.2～0.4）mg/L IAA+2.0 mg/L 6-BA上，愈傷組織的體積較大，結(jié)構(gòu)致密，生長速度快，為最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，這與孫靖棣[20]、范錫麟[21]等的研究結(jié)果相似。不同激素濃度對不定芽分化的影響差別顯著。IAA濃度為0.1 mg/L時，正常不定芽發(fā)生率較高，隨著IAA濃度增大正常芽率降低；6-BA濃度增加到3.0 mg/L以上時，剛萌發(fā)的芽不能正常生長，導(dǎo)致正常芽率下降。在MS+0.1 mg/L IAA+（1.0～3.0）mg/L 6-BA上不定芽的誘導(dǎo)效果最好，為最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。圣女櫻桃番茄的不定芽不適合在無激素的MS或1/2MS培養(yǎng)基中生根，最佳生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA。

添加抗氧化劑是抑制褐化現(xiàn)象發(fā)生的有效方法之一，本試驗結(jié)果表明，當(dāng)VC濃度為10 mg/L時，能明顯抑制褐化的發(fā)生。

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