阿霉素致斑馬魚心血管毒性模型的建立

張城達(dá), 張麗麗, 張立將, 陳云祥

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 杭州　310012）

阿霉素致斑馬魚心血管毒性模型的建立

張城達(dá), 張麗麗, 張立將, 陳云祥

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 杭州310012）

目的采用阿霉素（doxorubicin, DOX）作為陽性藥物建立斑馬魚的心血管毒性模型。方法確定DOX的10%致死濃度（LC10）與最大非致死濃度（MNLC）, 設(shè)置4個(gè)不同濃度的DOX溶液組（濃度： MNLC/10、MNLC/3、MNLC和LC10）、空白對照組（養(yǎng)魚水處理組）和溶劑對照組（0.9%NaCl注射液）處理一定階段的野生型AB系斑馬魚幼魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)受精后72 h（72 hpf）。在72 hpf處收集藥物處理的斑馬魚，Western blotting分析心肌肌鈣蛋白T（cTnT）和肌紅蛋白（Mb）的表達(dá)，在立體解剖顯微鏡下觀察心血管系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)改變，熒光定量RT-PCR檢測斑馬魚組織中miRNA146a的表達(dá)。結(jié)果在濃度≤MNLC/10時(shí), DOX不誘發(fā)斑馬魚心血管毒性； 當(dāng)濃度≥MNLC/3時(shí)，可誘發(fā)斑馬魚心血管毒性，表現(xiàn)為血流變慢、血流缺失、靜脈竇處瘀血和靜脈竇處水腫，且具有劑量相關(guān)性。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，DOX的三個(gè)劑量MNLC/3、MNLC、LC10均顯著提高miRNA146a的表達(dá)（與空白對照組比較，P＜0.01），且存在一定的劑量關(guān)系。Western blotting結(jié)果顯示, DOX模型組的cTnT和Mb蛋白表達(dá)與空白對照組比較均未見明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論DOX對斑馬魚的心血管毒性作用明顯, 可以作為藥物評(píng)價(jià)的心血管毒性模型。

阿霉素（DOX）； 心血管毒性； 斑馬魚； 模型

斑馬魚原產(chǎn)于印度東部、尼泊爾等地，是一種熱帶觀賞魚，因其體側(cè)具有5條延伸至尾部的水平藍(lán)色條紋而得名［1］。斑馬魚作為一種新型脊椎模式動(dòng)物的研究, 國際上最早于1930年代首次發(fā)表，第一次詳細(xì)描述了斑馬魚受精卵的變化過程［2］。而我國自20世紀(jì)末開始對其展開了大量研究，取得了快速發(fā)展。斑馬魚個(gè)體小，繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短, 成本低廉，既適合高通量的毒性篩選又可從整體發(fā)育水平上進(jìn)行觀察，兼具體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，且其基因組與人類基因組的相似度高達(dá)87%［3,4］，因此已廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、安全藥理學(xué)等研究。阿霉素（doxorubicin, DOX）是一種廣譜蒽環(huán)類抗腫瘤藥, 主要用于白血病、實(shí)體瘤及多種癌癥的治療, 但由于其嚴(yán)重的劑量依賴性的心臟毒性,使其臨床應(yīng)用受到了限制［5］。本研究以DOX為陽性藥物建立斑馬魚心臟毒性的模型，旨在為新藥心血管毒性的高通量篩選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚胚胎由杭州環(huán)特生物科技有限公司自行生產(chǎn)。斑馬魚的繁殖以自然成對交配的方式進(jìn)行。每次交配準(zhǔn)備4～5對成年斑馬魚，平均每對能產(chǎn)200～300個(gè)胚胎。在受精后6 h（6 hpf）和24 hpf對胚胎進(jìn)行清理（移除已死亡胚胎），并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。在28 ℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎（養(yǎng)魚用水水質(zhì)：每1L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽, 電導(dǎo)率為480～510 μS/cm； pH為6.9～7.2； 硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3）。因?yàn)榕咛タ梢詮淖陨淼穆腰S囊中獲取營養(yǎng)物質(zhì)，所以在受精后9 d內(nèi)（9 dpf）不需要喂食。實(shí)驗(yàn)完成后，用三卡因甲磺酸對各個(gè)發(fā)育階段的斑馬魚進(jìn)行過度暴露處理，從而將斑馬魚麻醉處死。

1.2藥物、儀器與試劑

DOX, Pfizer公司生產(chǎn), 規(guī)格： 10 mg/瓶。解剖顯微鏡（SZX7, Olympus, Japan）； 與顯微鏡相連的相機(jī)（TK-C1481EC, JVC, Japan）六孔板（Nest Biotech, Shanghai, China）； 心肌肌鈣蛋白T（cTnT）和肌紅蛋白（Mb）單克隆抗體（GeneTex, USA）； HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG （H+L）（Multisciences, China）； 甲基纖維素（Aladdin, Shanghai, China）； miR-146a以及U6逆轉(zhuǎn)引物由ABI公司提供。

1.3方法

1.3.1確定DOX的致死濃度LC10和最大非致死濃度MNLC用DOX溶液處理一定階段的野生型AB系斑馬魚幼魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（72 hpf）。DOX五個(gè)初始濃度設(shè)置為100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、15 μmol/L和5 μmol/L, 同時(shí)設(shè)置空白對照組（養(yǎng)魚水注射組）和溶劑對照組（0.9%NaCl注射液）； 每個(gè)濃度處理30尾斑馬魚； 藥物處理至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn), 統(tǒng)計(jì)各劑量組斑馬魚死亡數(shù)量, 繪制最佳濃度效應(yīng)曲線, 并使用Origin統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算MNLC和LC10值； 若在所設(shè)置的濃度范圍內(nèi), 有濃度出現(xiàn)全部死亡, 且MNLC和LC10值無法求得, 則縮小濃度范圍, 重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟。1.3.2DOX的心血管毒性評(píng)價(jià)DOX溶液（濃度：MNLC/10、MNLC/3、MNLC和LC10）處理一定階段的野生型AB系斑馬魚幼魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn), 同時(shí)設(shè)置空白對照組（養(yǎng)魚水處理組）和溶劑對照組（0.9%NaCl注射液）； 每個(gè)濃度處理30尾斑馬魚。待測藥物處理至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，在立體解剖顯微鏡下觀察有無心包水腫、血流速度變化、血栓及出血等，計(jì)算各表型發(fā)生率。

1.3.3RT-PCR檢測斑馬魚組織中miRNA146a的表達(dá)DOX溶液濃度均設(shè)置為MNLC/10、MNLC/3、MNLC和LC10, 并分別設(shè)置空白對照組（養(yǎng)魚水處理組）和溶劑對照組（0.9%NaCl注射液）處理組； DOX每個(gè)濃度均處理50尾斑馬魚, 每個(gè)濃度兩個(gè)重復(fù)； 處理至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn), 每個(gè)濃度收集100尾斑馬魚（-80 ℃貯存）, 提取mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA樣本后, 進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測。

在72 hpf處收集藥物處理的斑馬魚胚胎，各劑量組30枚，放置于1.5 mL無RNA酶離心管中。用焦碳酸二乙酯（DEPC）水沖洗2次，然后加入1.0mLTrizol（加入Trizol的斑馬魚如不立即提取RNA,可置于-80℃保存）。

將裝有Trizol和胚胎的1.5 mL離心管置于冰上,用經(jīng)DEPC水浸泡的并高壓滅菌的研磨棒進(jìn)行研磨,使其裂解直至沒有較大組織塊為止, 然后按照說明書使用Trizol方法提取總RNA, 提取的總RNA加入去酶水（RNase Free ddH20）20 μL, 吹打均勻, 溶解RNA, 1 h后用分光光度計(jì)測RNA濃度, 并將其置于-80℃保存。

利用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA, 按照說明書步驟操作, 每一個(gè)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包括100 ng總RNA, 50 mmol/L引物, 1×RT緩沖液, 0.25 mmol/L dNTP, 0.25 U/μL RNA酶抑制劑和3.33 U/μL反轉(zhuǎn)錄酶, 總體系15 μL。

RT-PCR引物如下：

MiR-146a：正義，5'-CGGCGGTGAGAACTGAATTCCA-3'； 反義, 5'-GTG CAGGGTCCGAGGT-3'；U6 snRNA： 正義, 5'-TCGCTACGGTGGCACATA-3'；反義, 5'-TATGGAGCGCTTCACGG-3'

每一個(gè)PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熔解曲線分析，以保證只有一種cDNA的擴(kuò)增，利用△△Ct 計(jì)算各組斑馬魚組織中miRNA146a的相對含量。

1.3.4Western blotting分析心臟蛋白類生物標(biāo)志物cTnT和Mb在72 hpf處收集藥物處理的斑馬魚, 各劑量組30枚, 按蛋白抽提試劑盒抽提總蛋白, 蛋白濃度測定按BCA蛋白濃度測定試劑盒相關(guān)說明操作。將各蛋白樣品上樣, 經(jīng)10%SDS-PAGEA, 轉(zhuǎn)膜, 放入新配制5%脫脂奶粉TBST中37℃封閉2 h, 加入一抗（1∶1 000） 4 ℃過夜, 加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG （H+L）（1∶2 000） 37℃作用1h, 電化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色。

1.4統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（>± s）表示，用單因素方差分析（ANVOA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DOX的LC10和MNLC

DOX“濃度-致死”原始數(shù)據(jù)如表1和表2所示, 基于“濃度-致死”原始數(shù)據(jù), 利用Origin模擬求得, DOX的MNLC和LC10分別為6.75 μmol/L 和7.2 μmol/L, 濃度-致死曲線如圖1所示。

2.2DOX的心血管毒性

心血管毒性結(jié)果顯示與溶劑對照組（0.9%NaCl）比較, MNLC/10處理組斑馬魚未見異常, 沒有觀察到心血管毒性； MNLC/3處理組斑馬魚出現(xiàn)心血管毒性,表現(xiàn)為血流變慢（發(fā)生率26.7%）、血流缺失（發(fā)生率6.7%）、靜脈竇處瘀血（發(fā)生率40.0%）和靜脈竇處水腫（發(fā)生率16.7%，如圖2所示）； MNLC和LC10處理組斑馬魚出現(xiàn)較嚴(yán)重的心血管毒性, 表現(xiàn)為血流完全缺失（發(fā)生率均為100%）、靜脈竇處瘀血（發(fā)生率均為100%）和靜脈竇處水腫（發(fā)生率分別為26.7%和73.3%）。這些結(jié)果提示DOX在濃度≤MNLC/10時(shí),不誘發(fā)斑馬魚心血管毒性； 當(dāng)濃度≥MNLC/3時(shí), 可誘發(fā)斑馬魚心血管毒性。

表 1　DOX濃度與致斑馬魚死亡情況 （n=30）

圖1　DOX“濃度-致死”曲線

2.3DOX對斑馬魚組織中miRNA146a表達(dá)的影響

熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示, DOX的三個(gè)劑量MNLC/3、MNLC、LC10均顯著提高miRNA146a的表達(dá)（與對照組比較P＜0.01）, 且存在一定劑量關(guān)系（圖3）。

2.4DOX對斑馬魚心臟蛋白類生物標(biāo)志物的影響

Western blotting結(jié)果顯示, Dox模型組的cTnT 和Mb蛋白表達(dá)與空白對照組比較均未見明顯變化（P＞0.05）（圖4）。

表 2　斑馬魚心血管毒性各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)生率　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　%

圖2　斑馬魚心血管毒性表型

圖3　DOX對斑馬魚組織中miRNA146a表達(dá)的影響

圖4　Western blotting分析DOX對斑馬魚組織中cTnT和Mb蛋白表達(dá)的影響

3　討論

斑馬魚作為新型的脊椎模式動(dòng)物，已成為國內(nèi)外熱點(diǎn)。由于其符合“3R”原則，被歐洲替代法驗(yàn)證中心（ECVAM）推薦為新的替代動(dòng)物［6］。自1990年代起, 在我國開始應(yīng)用于藥物毒理與安全性評(píng)價(jià)。斑馬魚早期胚胎及幼魚通體透明, 發(fā)育24 h后幾乎所有臟器均已成型, 其心臟體節(jié)清晰利用體視顯微鏡即可直接觀察及拍攝［7］。斑馬魚的心臟只有一個(gè)心房與一個(gè)心室, 結(jié)構(gòu)類似3周的人胚胎心臟［8］。它早期的發(fā)育存活不依賴于血液循環(huán), 可以在缺血的狀態(tài)依靠氧擴(kuò)散下存活一段時(shí)間，相比于哺乳動(dòng)物缺血后死亡、心臟失活, 斑馬魚這一特點(diǎn)更利于尋找心臟發(fā)育或功能缺陷突變體［9］。因而斑馬魚非常適合心血管藥物的研究, 是一個(gè)很好的脊椎模式動(dòng)物模型。如吳曉敏等［10］采用阿司咪唑處理72 hpf斑馬魚, 發(fā)現(xiàn)斑馬魚出現(xiàn)心率下降、SV-BA間距增大、全身無血流、心臟停跳等中毒現(xiàn)象并具有時(shí)間、劑量依賴性。王思鋒等［11］以不同濃度的雷公藤紅素處理發(fā)育48 h斑馬魚胚胎, 結(jié)果顯示雷公藤紅素能引起胚胎心臟中毒、心率下降等現(xiàn)象。方芳等［12］觀察不同濃度烏頭堿對斑馬魚心臟的影響,證實(shí)烏頭堿可導(dǎo)致胚胎心臟出現(xiàn)心膜出血、心包囊水腫等中毒現(xiàn)象, 且與烏頭堿的濃度呈正相關(guān)。

DOX的臨床應(yīng)用受到其嚴(yán)重的心臟毒性所限制，多數(shù)研究認(rèn)為，DOX的心臟毒性機(jī)制可能包括自由基損傷、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、鈣超載等，但氧化應(yīng)激為其主要的機(jī)制之一［13］。DOX在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為具有毒性的半醌阿霉素，與分子氧相互作用，發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生活性氧?；钚匝跖c細(xì)胞內(nèi)成分作用, 造成脂質(zhì)過氧化，對心肌細(xì)胞膜和線粒體膜造成氧化損傷［14］。由于心肌細(xì)胞的過氧化物酶活性偏低，因而心臟毒性更為明顯。本研究通過檢測與氧化應(yīng)激水平相關(guān)的靈敏度較高的生物標(biāo)志物miRNA146a的表達(dá), 證實(shí)DOX的三個(gè)劑量MNLC/3、MNLC、LC10均顯著提高miRNA146a的表達(dá)（與對照組比較P＜0.01），即miRNA146a的表達(dá)升高，則氧化應(yīng)激水平增加。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的DOX處理72 hpf斑馬魚,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)濃度≥MNLC/3（MNLC=6.75 μmol/L）時(shí), 可誘發(fā)斑馬魚血流變慢、血流缺失、靜脈竇處瘀血和靜脈竇處水腫等心血管毒性, 且具有劑量相關(guān)性。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示, DOX的三個(gè)劑量MNLC/3、MNLC、LC10均顯著提高miRNA146a的表達(dá)（與對照組比較P＜0.01）, 且存在一定的劑量關(guān)系。Western blotting結(jié)果顯示, DOX模型組的cTnT 和Mb蛋白表達(dá)與空白對照組比較均未見明顯變化（P＞0.05）。與前期本研究組用DOX建立的SD大鼠心臟損傷動(dòng)物模型相比較，發(fā)現(xiàn)DOX可以致斑馬魚心臟在外觀上發(fā)生明顯變化, 同時(shí)miRNA146a的表達(dá)也同樣發(fā)生顯著變化，同樣對cTnT和Mb蛋白的表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化。說明斑馬魚模型與哺乳動(dòng)物模型具有良好的相關(guān)性［15］。本研究模型的建立可以為新藥心血管毒性的高通量篩選體系以及安全性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)依據(jù)和技術(shù)支持。

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Estabilishment of Cardiotoxicity Model in Zebrafish Induced by Doxorubicin

ZHANG Cheng-da, ZHANG Li-li, ZHANG Li-jiang, CHEN Yun-xiang
（Zhejiang Acadamy of Medical Science， Hangzhou 310012， China）

ObjectiveTo establish zebrafish model of cardiotoxicity induced by doxorubicin （DOX）. MethodsThe wild type zebrafish was divided into 6 groups： 4 different concentrations of DOX solution, control group and 0.9% NaCl groups. To assay the expression of cardiac troponin T（cTnT） and myoglobin （Mb） by Western blot at 72 hpf （72 hours post fertilization）. Morphologic changes in the cardiovascular system were observed understereomicroscope. The expression of miRNA146a in zebrafish was tested by RT-PCR. ResultsDOX had no cardiotoxicity in zebrafish within 0～MNLC/10； when the concentration of DOX ≥MNLC/3, it can be induced cardiovascular toxicty in the zebrafish, manifested as blood flow slows down, the lack of blood flow, venous sinus congestion, venous sinus edema and it is dose-dependent. Tissue expression of miRNA146a on zebadfishes of 3 concentrations were all increased compared with control group （P＜0.01）, and it is dose-dependent. There was no significant differences in the expression of cTnT and Mb between DOX groups and control group （P＞0.05）. ConclusionThe cardiotoxicity induced by DOX was significant and ithad a similar toxic effect to mammal. So the zebrafish model of cardiotoxicity induced by DOX was successfully established.

Doxorubicin （DOX）； Cardiotoxicity； Zebrafish； Model

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0362-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.004

2015-03-25

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012C37098）， 浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010F10026），浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014KYA046）

張城達(dá)（1983-）, 男, 研究實(shí)習(xí)員, 研究方向： 藥物毒理學(xué)。E-mail： zcdhd@163.com

陳云祥（1975-）, 男, 高級(jí)實(shí)驗(yàn)師, 研究方向： 藥物毒理學(xué)。E-mail： cyx75001@163.com