PFC體內(nèi)遞增誘導(dǎo)建立S180腫瘤多藥耐藥模型及其穩(wěn)定性觀察

顧云浩, 曹晨潔, 胡碧原, 王　俊, 韓東冬, 許愛華

（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 揚(yáng)州　225001）

PFC體內(nèi)遞增誘導(dǎo)建立S180腫瘤多藥耐藥模型及其穩(wěn)定性觀察

顧云浩, 曹晨潔, 胡碧原, 王俊, 韓東冬, 許愛華

（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 揚(yáng)州225001）

目的小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)建立獲得性S180多藥耐藥（multi-drug resistance, MDR）模型及其穩(wěn)定性觀察。方法模擬臨床順鉑+氟尿嘧啶+環(huán)磷酰胺（PFC）化療方案給藥, 分三個階段劑量遞增法誘導(dǎo)S180腹水瘤小鼠, 建立獲得性S180MDR實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。采用噻唑藍(lán)（MTT）法、流式細(xì)胞術(shù)動態(tài)檢測各階段所誘導(dǎo)細(xì)胞對化療藥物的耐藥倍數(shù)、細(xì)胞內(nèi)藥物積累量及細(xì)胞膜P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）功能活性，并通過檢測以上指標(biāo)觀察各階段所誘導(dǎo)細(xì)胞停藥后的耐藥穩(wěn)定性； 采用實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測各階段所誘導(dǎo)細(xì)胞MDR-1 mRNA、多藥耐藥相關(guān)蛋白-1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP-1） mRNA的表達(dá)量。結(jié)果與親本細(xì)胞對照組比較，各階段所誘導(dǎo)S180細(xì)胞對化療藥物的耐藥倍數(shù)隨著誘導(dǎo)時間延長和劑量增高而逐漸增大, 細(xì)胞內(nèi)阿霉素（adriamycin, ADR）積累量逐漸減少, 細(xì)胞P-gp功能活性逐漸增強(qiáng)； 各階段所誘導(dǎo)S180細(xì)胞MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA的表達(dá)量也與誘導(dǎo)時間和給藥劑量呈正相關(guān)； 第一、二和三階段所誘導(dǎo)細(xì)胞的穩(wěn)定耐藥時間分別為1周、2周和3周左右。結(jié)論模擬臨床PFC化療方案給藥，采用分階段劑量遞增小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)法可建立耐藥強(qiáng)度高、穩(wěn)定時間長的獲得性S180MDR實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

順鉑+氟尿嘧啶+環(huán)磷酰胺（PFC）； 多藥耐藥（MDR）； S180細(xì)胞株； 體內(nèi)；細(xì)胞膜P-糖蛋白（P-gp）； MDR-1 mRNA； 多藥耐藥相關(guān)蛋白-1（MRP-1） mRNA

腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR）是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時，對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，使抗腫瘤化學(xué)治療達(dá)不到預(yù)期的臨床效果。如果在進(jìn)行多個療程化療的同時合用有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑，將有利于提高抗腫瘤化療療效。目前，雖然有很多研究文獻(xiàn)顯示，一些藥物在體外試驗(yàn)具有很好的MDR逆轉(zhuǎn)作用［1,2］，但真正可用于臨床的逆轉(zhuǎn)劑卻很少，其主要原因之一是逆轉(zhuǎn)劑的藥效學(xué)研究大多采用體外給藥方法誘導(dǎo)的MDR細(xì)胞株［3-6］及其動物模型［7］，而癌癥患者M(jìn)DR的形成過程是受機(jī)體各種內(nèi)環(huán)境影響的。因此, 建立接近于臨床的MDR實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪菍ふ矣行DR逆轉(zhuǎn)劑的重要基礎(chǔ)。本研究模擬臨床常用聯(lián)合化療順鉑+氟尿嘧啶+環(huán)磷酰胺（PFC）方案，體內(nèi)給藥, 采用分階段劑量遞增法誘導(dǎo)S180腹水瘤小鼠, 建立了獲得性S180MDR細(xì)胞株及其動物模型, 并觀察其穩(wěn)定性。

1　材料與方法

1.1動物與細(xì)胞

6～8周齡SPF級ICR小鼠, 雌雄兼用, 體質(zhì)量20±2 g, 由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供［SCXK（蘇）2012-0004］； 小鼠S180肉瘤細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所,體外培養(yǎng)擴(kuò)增后接種于ICR小鼠腹腔內(nèi)，7～8 d傳代1次。

1.2試劑

順鉑注射液（DDP，江蘇豪森制藥股份有限公司，批號： 130603），氟尿嘧啶注射液（FU，天津金耀氨基酸有限公司，批號： H12020959），注射用環(huán)磷酰胺（CPA, 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司, 批號：13022625）, 注射用鹽酸阿霉素（ADR, 浙江海正藥業(yè)股份有限公司, 批號： 120701）, 羅丹明123（Rho123，Sigma，批號： MKBC2653V），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料公司），青霉素（重慶市先鋒動物藥業(yè)有限公司）, 鏈霉素（江西省和光藥業(yè)有限公司），RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco），Trizol試劑盒、引物（生工生物工程上海有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（TaKaRa公司）。

1.3主要儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），COIC XSZ-D2倒置顯微鏡（中國重慶光子儀器廠產(chǎn)品），ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO-TEK, 美國）, CO2培養(yǎng)箱（Thermo）, 分析型流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur）,核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司），PCR儀、實(shí)時定量PCR儀（ABI公司）。

1.4小鼠體內(nèi)S180MDR模型的建立

取S180腹水瘤小鼠，無菌條件下抽取腹水，用無菌生理鹽水稀釋制成腫瘤細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/mL。分別取0.2 mL細(xì)胞懸液從右下腹部注入小鼠腹腔內(nèi)，24 h后，模擬臨床常用的PFC聯(lián)合化療方案給藥，采用分階段劑量遞增誘導(dǎo)法。DDP, ip, 每周一次； FU, ig, 每日一次； CPA，ig, 每日一次。不同階段的給藥劑量具體如下, 第一階段： DDP 3.0 mg/kg+FU 3.0 mg/kg+CPA 3.0 mg/kg, 誘導(dǎo)時間為第一代和第二代； 第二階段：DDP 4.0 mg/kg+FU 6.0 mg/kg+CPA 6.0 mg/kg, 誘導(dǎo)時間為第三代和第四代； 第三階段： DDP 5.0 mg/kg +FU 12.0 mg/kg+CPA 12.0 mg/kg, 誘導(dǎo)時間為第五代和第六代。根據(jù)腹水生長的速度確定傳代時間。

1.5S180MDR模型的驗(yàn)證

1.5.1噻唑藍(lán)（MTT）法測定各化療藥物的耐藥倍數(shù)取親本S180細(xì)胞和各階段誘導(dǎo)的S180細(xì)胞懸液, 均以1×l05/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板, 100 μL/孔。然后分別給予ADR、DDP和FU 6個不同濃度，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、親本細(xì)胞對照組、誘導(dǎo)細(xì)胞組及各濃度給藥組。37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)44 h后，吸取上清100 μL棄之，每孔加5 mg/mL MTT 溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h后，每孔加鹽酸異丙醇100 μL，振蕩10 min，吹打均勻后震蕩器上充分混勻, 于自動酶標(biāo)儀490 nm波長下測定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率、半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥倍數(shù)。細(xì)胞生長抑制率= （1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度） ×100%； 耐藥倍數(shù)=誘導(dǎo)細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.5.2流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)ADR積累量收集親本S180細(xì)胞和各階段所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞，用含5 μg/mL ADR的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至細(xì)胞數(shù) 1×106/mL, 分別接種于 24孔板, 每孔終體積為2 mL, 每組3個平行樣品。37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱條件下溫育3 h，然后用3 mL左右的冷PBS吹洗，反復(fù)3次。最后用1 mL冷PBS液制成懸液于流式細(xì)胞管內(nèi)，吹散細(xì)胞，立即用流式細(xì)胞儀檢測10 000個細(xì)胞內(nèi)ADR的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。結(jié)果以MFI代表細(xì)胞內(nèi)ADR濃度。ADR選用激發(fā)波長488 nm, 發(fā)射波長575 nm。

1.5.3流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞膜P-糖蛋白的功能采用Rho123蓄積和泵出實(shí)驗(yàn)檢測親本與耐藥細(xì)胞膜上P-糖蛋白（P-gp）活性的差別［8,9］。測定 Rho123在細(xì)胞內(nèi)的蓄積時，收集親本S180細(xì)胞和各階段所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞，用含2.0 μg/mL Rho123的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至細(xì)胞數(shù) 1×106/mL， 分別接種于 24 孔板, 每孔終體積為1.0 mL, 每組3個平行樣品。在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱條件下溫育3 h, 然后用3.0 mL左右的冷PBS吹洗, 反復(fù)3次。最后用1.0 mL冷PBS液制成懸液于流式細(xì)胞管內(nèi), 吹散細(xì)胞, 立即用流式細(xì)胞儀檢測10 000個細(xì)胞內(nèi)Rho123的MFI。結(jié)果以MFI代表細(xì)胞內(nèi)Rho123濃度。

測定 Rho123 在細(xì)胞內(nèi)的泵出時, 收集親本S180細(xì)胞和各階段所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞，用含2.0 μg/mL Rho123的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至細(xì)胞數(shù) 1×106/mL，分別接種于 24 孔板，每孔終體積為1.0 mL，每組3個平行樣品。在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱條件下溫育2 h，然后用3.0 mL左右的冷PBS反復(fù)吹洗2次，重懸于不含Rho123的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用冷PBS吹洗2次后, 最后用1.0 mL冷PBS液制成懸液于流式細(xì)胞管內(nèi), 吹散細(xì)胞, 立刻用流式細(xì)胞儀檢測10 000個細(xì)胞內(nèi) Rho123的MFI。結(jié)果以MFI代表細(xì)胞內(nèi)Rho123濃度。Rho 123選用的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

1.5.4RT-qPCR測定MDR-1 mRNA與MRP-1 mRNA的表達(dá)量采用RT-qPCR法檢測細(xì)胞內(nèi)MDR-1 mRNA和MRP-1 mRNA的表達(dá)量。目的基因MDR-1的上游引物： 5c -ATGACACCCCTGAAATCCA-3c, 下游引物： 5c-CGCTCCTGTGGTGTTTTTA-3c, 擴(kuò)增產(chǎn)物為215 bp； 目的基因MRP-1的上游引物： 5c-CCTACTACCCCAGCATTGT-3c, 下游引物： 5c-TATTCCTTCAGTCTCTCCAC-3c, 產(chǎn)物擴(kuò)增片段238 bp；內(nèi)參GAPDH的上游引物：5c-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3c, 下游引物：5c-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3c，擴(kuò)增產(chǎn)物為450 bp。取親本細(xì)胞和各階段誘導(dǎo)的S180細(xì)胞，采用TRizo1法分別提取細(xì)胞中 RNA，測定終溶液中D260/D280與RNA濃度。按兩步法 RT-qPCR 試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA, 并進(jìn)行SYBR Green法熒光定量PCR分析各基因的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為（1） 37℃ 15 min；（2）85 ℃ 5 s, 然后冷卻至4 ℃； PCR反應(yīng)條件為（1） 95℃預(yù)變性30 s； （2） 95 ℃，5 s； （3）60 ℃, 34 s； 共40個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線實(shí)驗(yàn)，條件為95℃, 15 s； 60℃, 1 min； 95℃, 15 s。最終結(jié)果用2-△△Ct法進(jìn)行各基因表達(dá)的相對定量分析。1.6S180MDR模型的穩(wěn)定性觀察

將各階段細(xì)胞末次傳代后, 停止給予化療藥物，正常飼養(yǎng)、傳代, 分別在停藥1、2或3周時，取各階段所誘導(dǎo)細(xì)胞，按1.5.1、1.5.2、1.5.3項(xiàng)下方法，測定細(xì)胞對各化療藥物的耐藥倍數(shù)、細(xì)胞內(nèi)ADR含量及細(xì)胞膜P-gp功能活性。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用±s表示，兩樣本之間采用t檢驗(yàn)，多樣本之間采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞的耐藥倍數(shù)

隨著誘導(dǎo)時間延長和劑量增大，各階段所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞對各化療藥物的耐藥倍數(shù)逐漸增大（表1），提示本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)建立耐藥細(xì)胞株的方法可以使敏感型細(xì)胞獲得耐藥性。根據(jù)Sonw［10］等標(biāo)準(zhǔn)（耐藥倍數(shù)＜5為低度耐藥，5～15為中度耐藥，＞15為高度耐藥），第一階段誘導(dǎo)的細(xì)胞為低度耐藥，而第二、三階段的可達(dá)到中度耐藥； 表1結(jié)果還顯示，所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞對ADR也具有一定的耐藥性，提示其對結(jié)構(gòu)不同的其他化療藥物也產(chǎn)生了耐藥性，具有MDR的特點(diǎn)。表2結(jié)果顯示，第一階段所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞停藥1周時對各化療藥物的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)皆＞1.0，但停藥2周時除了FU, 對其它化療藥物的耐藥倍數(shù)皆＜1.0, 提示其耐藥穩(wěn)定期只能維持1周； 第二階段、第三階段所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞停藥后其耐藥穩(wěn)定期則分別為2周和3周； 表2結(jié)果還顯示，同期比較，停藥2周時，第二、三階段細(xì)胞各耐藥倍；數(shù)均明顯高于第一階段的，停藥3周時，第三階段的耐藥倍數(shù)均略高于第二階段的，顯示其誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑量與所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞在停藥后對各化療藥物的耐藥強(qiáng)度和穩(wěn)定性具有一定的正相關(guān)關(guān)系。

2.2細(xì)胞內(nèi)ADR的積累量

藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累量是其發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。與親本細(xì)胞相比，藥物在耐藥細(xì)胞內(nèi)的積累量會有所減少。圖1結(jié)果顯示, 各階段所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞內(nèi)ADR的積累量隨著誘導(dǎo)時間延長、劑量增大而逐漸減少, 與相應(yīng)親本細(xì)胞的比較均具有顯著性差異。圖2結(jié)果顯示, 第一階段在停藥1周和2周時與相應(yīng)的親本細(xì)胞比較，所誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ADR的積累量也均有所減少（P＜0.001和P＜0.05）, 但停藥1周的減少更明顯； 各階段在停藥2周時除了所誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ADR的積累量顯著減少, 還顯示其減少程度與誘導(dǎo)劑量和時間具有一定的正相關(guān)關(guān)系； 第二、三階段停藥3周時細(xì)胞內(nèi)ADR積累量也皆有所減少，但第二階段的與親本細(xì)胞比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表 1　各階段細(xì)胞對各化療藥物的耐藥倍數(shù)（n=6）

表 2　各階段誘導(dǎo)細(xì)胞停藥后耐藥倍數(shù)測定（n=6）

2.3P-gp的功能活性

圖1　各階段細(xì)胞內(nèi)ADR的積累量

圖2　各階段停藥后細(xì)胞內(nèi)ADR的積累量

Rho123是特異性較強(qiáng)的P-gp底物，通過檢測細(xì)胞對Rho123的蓄積和泵出反映其P-gp功能活性強(qiáng)弱。圖3結(jié)果顯示，各階段所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞對Rho123的蓄積量隨著誘導(dǎo)時間延長、給藥劑量增大而逐漸減少（圖3A），而對Rho123的泵出量則逐漸增多（圖3B），分別與相應(yīng)的親本細(xì)胞對照組比較均具有顯著性差異，表明經(jīng)過各階段體內(nèi)誘導(dǎo)的S180細(xì)胞P-gp功能活性逐漸增強(qiáng)，即產(chǎn)生了不同程度的MDR。圖4結(jié)果顯示, 各階段停藥后的不同時間, 所誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Rho123的蓄積量仍然均低于親本細(xì)胞對照組（圖4A），而泵出量則反之（圖4B），除了第一階段停藥后第二周和第二階段停藥后第三周的, 皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示所誘導(dǎo)的細(xì)胞在停藥后的一段時間仍然具有不同程度的耐藥穩(wěn)定性，該穩(wěn)定性與誘導(dǎo)劑量和時間具有一定的正相關(guān)。

2.4細(xì)胞MDR-1 mRNA和MRP-1 mRNA表達(dá)量用核酸蛋白測定儀測定提取的RNA溶液D260/ D280值, 結(jié)果為1.6～1.8, 然后調(diào)節(jié)濃度后采用RT-qPCR法分別檢測親本S180細(xì)胞與不同階段所誘導(dǎo)的S180

圖3　各階段細(xì)胞內(nèi)Rho123蓄積量（A）和泵出后細(xì)胞內(nèi)剩余量（B）

圖4　各階段停藥后細(xì)胞內(nèi)Rho123的蓄積量（A）和泵出后細(xì)胞剩余量（B）

圖5　2-△△Ct法進(jìn)行各基因表達(dá)的相對定量分析過程

表 3　各階段細(xì)胞中MDR-1mRNA和MRP-1mRNA的表達(dá)量（n=3）

3　討論

圖6　各階段細(xì)胞MDR-1 mRNA和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線

模擬PFC聯(lián)合化療給藥方案, 通過小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)MDR細(xì)胞株的研究已有一些報道［11］, 但由于所用化療藥物大多劑量偏低，因而所建立的耐藥細(xì)胞株其耐藥強(qiáng)度不高，耐藥穩(wěn)定持續(xù)時間較短, 僅1周左右［12］, 而大多中藥逆轉(zhuǎn)劑起效較慢, 故現(xiàn)有MDR實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒惶m合中藥或植物提取物類逆轉(zhuǎn)劑的研細(xì)胞中MDR-1 mRNA和MRP-1 mRNA的表達(dá)量, 各基因表達(dá)的相對定量結(jié)果用2-△△Ct法進(jìn)行分析（圖5）。表3結(jié)果顯示, 三個階段所誘導(dǎo)細(xì)胞中MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA的表達(dá)量均高于親本細(xì)胞, 除了第一階段的MDR-1, 皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； 結(jié)果還顯示各階段所誘導(dǎo)細(xì)胞的基因表達(dá)量與誘導(dǎo)藥物的給藥時間和劑量呈正相關(guān)關(guān)系。圖6、圖7的熔解曲線分析顯示兩種細(xì)胞MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA及GAPDH的PCR產(chǎn)物均為單一峰, 沒有其他雜質(zhì)峰出現(xiàn), 可知采用SYBR Green 法熒光定量PCR 分析各基因的表達(dá)時, 熒光信號全部為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 無引物二聚體及干擾非特異性產(chǎn)物的干擾。究。此外, 有些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?3］未報道耐藥穩(wěn)定性考察結(jié)果, 或是考察時間較短, 因而影響模型復(fù)制的成功率。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谝延蠵FC方案基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn), 體內(nèi)給藥，采用分階段劑量遞增法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥, 其中DDP為3/4/5 mg/kg, FU和CPA均為3/6/12 mg/kg, 并動態(tài)檢測各階段誘導(dǎo)細(xì)胞的相關(guān)耐藥指標(biāo), 觀察隨著劑量遞增其耐藥強(qiáng)度的變化趨勢。結(jié)果顯示, 隨著PFC化療藥物劑量遞增, 所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞耐藥強(qiáng)度逐漸增強(qiáng), 并能耐受所用化療藥物的臨床最高給藥劑量, 提示被誘導(dǎo)細(xì)胞具有較高強(qiáng)度的耐藥性。各穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互驗(yàn)證, 均顯示第一階段誘導(dǎo)細(xì)胞的耐藥穩(wěn)定時間維持在1周左右,而第二、三階段則分別在2周和3周左右, 提示該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍退帍?qiáng)度高, 穩(wěn)定性好, 且耐藥強(qiáng)度與穩(wěn)定性與誘導(dǎo)時間和給藥劑量呈正相關(guān), 中藥及其提取物的逆轉(zhuǎn)劑建議使用第二、三階段所誘導(dǎo)的細(xì)胞。

圖7　各階段細(xì)胞MRP-1 mRNA和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線

研究表明MDR產(chǎn)生的機(jī)制與P-gp、MRP-1等多藥耐藥蛋白密切相關(guān)［14,15］。其中P-gp［16］為由mdr-1編碼的ATP依賴性藥物排出泵，MRP［17］是一種谷光甘肽-S的共軛轉(zhuǎn)運(yùn)泵, 它們皆可利用ATP提供的能量將胞內(nèi)抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外使抗腫瘤作用減弱, 其相關(guān)變化反應(yīng)細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生及其強(qiáng)度。本研究對所建模型動態(tài)測定不同階段所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞對化療藥物的耐藥倍數(shù)、細(xì)胞ADR的蓄積量及P-gp功能活性, 并同步測定細(xì)胞MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA的表達(dá)量，以通過多指標(biāo)相互驗(yàn)證各階段細(xì)胞的耐藥性。其中耐藥倍數(shù)以藥效的形式驗(yàn)證所誘導(dǎo)細(xì)胞對各化療藥物的敏感性, ADR的蓄積量反映化療藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多少, P-gp功能活性從蛋白層面驗(yàn)證所誘導(dǎo)細(xì)胞外排藥物的能力, 而MDR-1 mRNA、MRP-1mRNA表達(dá)量則從基因?qū)用骝?yàn)證所誘導(dǎo)細(xì)胞的耐藥特性。結(jié)果顯示, 所建模型細(xì)胞不僅對DDP、FU產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性, 且對未接觸過的、結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的ADR也具有一定程度的交叉耐藥性, 因而具有MDR特點(diǎn)。從具體結(jié)果來看, 隨著劑量增大, 各階段細(xì)胞對DDP、FU、ADM的耐藥倍數(shù)由最初的1.61、1.06、0.93增大到7.41、5.85、4.25；細(xì)胞內(nèi)ADR的積累量逐漸減少, 而細(xì)胞P-gp功能活性則逐漸增強(qiáng)； MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA的表達(dá)量也與誘導(dǎo)時間和給藥劑量正相關(guān)。

綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣討B(tài)、同步檢測的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果相互得到了驗(yàn)證, 一致提示了該MDR模型耐藥強(qiáng)度高、穩(wěn)定時間長, 具有較強(qiáng)的可行性和實(shí)用性，為相關(guān)逆轉(zhuǎn)劑的研究提供了較理想的動物體內(nèi)MDR模型建立方法，具有重要實(shí)踐應(yīng)用價值。

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Establishment of S180 Tumor Multidrug Resistance Mouse Model by Increasing PFC and Observation on Stability

GU Yun-hao, CAO Chen-jie, HU Bi-yuan, WANG Jun, HAN Dong-dong, XU Ai-hua
（Medical College， Yangzhou University， Yangzhou 225001， China）

ObjectiveTo establish aquired S180 multidrug resistance （MDR） mouse model and study on its stability. MethodsTo mimic the clinical PFC （cis-Dichlorodiamineplatinum+5-Fluorouracil+cyclophosphamide） scheme, gradually increase the dose in three phases to induce S180 ascites tumor mice and establish the aquired S180 MDR mouse model. The induced cells resistance factor to the chemotherapeutics drugs in different stages, the accumulation of adriamycin （ADR） and the functional activity of P-glycoprotein （P-gp） were detected by MTT assay and flow cytometry. And then through detecting the above indicators to monitor the resistance drug stability of induced cells in different stages. The mRNA expression of MDR-1 and multidrug resistance-associated protein 1 （MRP-1） of induced cells in different stages were detected by real time quantitative PCR （RT-qPCR）. ResultsCompared with the parent cells, with induction time extending and dose increasing, the resistance factors in each stage of induced S180 cells tochemotherapeutics drugs were gradually increased, the accumulation of ADR was gradually reduced, and the functional activity of P-gp was strengthened.The mRNA expression of MDR-1 and MRP-1 of induced cells in different stages had a positive correlation to the induction time and dose. The stable resistance time of induced cells in the first, second and third phase are respectively for about 1 week, 2 weeks and 3 weeks. ConclusionTo mimic the clinical PFC scheme, using the dose gradually increasing by phased can establish a high resistant strength, long stable time aquired S180MDR experimental model.

cis-Dichlorodiamineplatinum+5-Fluorouracil+cyclophosphamide （PFC）； Multidrug resistance；S180 cell line； in vivo； P-gp； multidrug resistance-1（MDR-1mRNA）；multidrug resistance-associated protein-1（MRP-1 mRNA）

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0367-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.005

2015-03-03

揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2014）； 江蘇省醫(yī)藥高技術(shù)研究項(xiàng)目（BG2007609）

顧云浩（1994-）, 男, 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院2012級在讀本科生。E-mail： 907745184@qq.com

許愛華（1957-）, 女, 教授, 主要從事腫瘤藥理學(xué)研究。 E-mail： ahxu@yzu.edu.cn