兩種大鼠骺板損傷模型的比較

景金珠, 李清海, 呂學(xué)敏, 梁　震, 王　猛

（1. 北京積水潭醫(yī)院 北京市創(chuàng)傷骨科研究所, 北京　100035；

2. 山東泰安軍分區(qū)第一干休所, 泰安　271000；

3. 北京積水潭醫(yī)院小兒骨科, 北京　100035）

兩種大鼠骺板損傷模型的比較

景金珠1, 李清海2, 呂學(xué)敏3, 梁震1, 王猛1

（1. 北京積水潭醫(yī)院 北京市創(chuàng)傷骨科研究所, 北京100035；

2. 山東泰安軍分區(qū)第一干休所, 泰安271000；

3. 北京積水潭醫(yī)院小兒骨科, 北京100035）

目的比較直接刮除法和手動(dòng)成角法制備的骺板損傷模型的差別，為更好地研究骺板損傷的病變進(jìn)程、治療和預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法4～5周齡Wistar大鼠45只，分為3組, 第1組為對(duì)照組，不作處理，正常飼養(yǎng)； 第2組為直接刮除組，直接切除脛骨上端前內(nèi)側(cè)骺板制作骺板損傷模型； 第3組為手動(dòng)成角組，采用外翻用力，并適當(dāng)加用剪切力使骨骺在骺板軟骨水平與干骺端分離制作骺板損傷模型。均于術(shù)后4 d、10 d和21 d處死，取雙側(cè)脛骨。行Micro-CT掃描，用系統(tǒng)分析軟件CTAn（comprehensive TeX archive network）測(cè)量各時(shí)間點(diǎn)雙側(cè)脛骨長(zhǎng)度、脛骨粗隆寬度以及脛腓骨之間最寬距離的差值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組織學(xué)切片HE染色，觀察損傷骺板在各時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果直接刮除法與手動(dòng)成角法Micro-CT、HE染色檢測(cè)顯示，二者在術(shù)后4 d均見(jiàn)到骺板寬度增加，前者出現(xiàn)周圍骨質(zhì)密度減低和幼稚軟骨細(xì)胞； 術(shù)后10 d，前者出現(xiàn)骺板變窄，后者開(kāi)始出現(xiàn)周圍骨質(zhì)密度減低；術(shù)后21 d，前者有明確的骨橋形成，骺早閉出現(xiàn)，后者僅見(jiàn)細(xì)小新生骨質(zhì)。標(biāo)本大體測(cè)量結(jié)果顯示，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兩種方法脛骨長(zhǎng)度差值、脛骨粗隆寬度差值以及脛腓骨之間最寬距離的差值均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）； 術(shù)后21 d，直接刮除組數(shù)據(jù)均大于手動(dòng)成角組（P＜0.05）； 術(shù)后4 d和10 d，兩種方法沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論直接刮除法制作的大鼠骺板損傷模型，具有相對(duì)明確的均一性和穩(wěn)定的造模成功率，更適合于對(duì)骺板損傷的機(jī)制探討等基礎(chǔ)性研究。

動(dòng)物模型； Micro-CT； 骺板損傷

兒童的骺軟骨和骺板軟骨遠(yuǎn)比骨骺和韌帶脆弱, 因此骺板損傷在兒童骨關(guān)節(jié)創(chuàng)傷中最為常見(jiàn), 據(jù)統(tǒng)計(jì), 兒童時(shí)期的長(zhǎng)管狀骨骨折, 約15%～18%累及骺板, 而因骺板損傷導(dǎo)致明顯畸形者約占10%［1］。骺板損傷導(dǎo)致骨骺與干骺端之間形成骨橋，使骺板全部或部分提前閉合，造成肢體短縮和（或）成角畸形［2］，影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育，而且其治療非常困難，目前尚無(wú)特異的治療手段。因此，骺板損傷一直是小兒骨科界研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，近年來(lái)不少學(xué)者致力于小兒骺板損傷的診斷和治療，在組織學(xué)、影像學(xué)、生物力學(xué)、分子生物學(xué)等方面取得了一定進(jìn)展［3,4］，各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床治療方法的報(bào)道也較為常見(jiàn)。骺板損傷按Salter-harris 分型法，分為五型［5］，其中Ⅱ型（剪式和推壓的合力，使骺板裂開(kāi)，同時(shí)引起干骺端骨折）最為多見(jiàn)。作者采用直接刮除法和手動(dòng)成角法構(gòu)建大鼠脛骨近端II型骺板損傷模型，并于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)取材，進(jìn)行組織學(xué)觀察、Micro-CT掃描并測(cè)量大體數(shù)據(jù)，動(dòng)態(tài)觀察和比較兩種方法制備骺板損傷模型的差異，為更好的研究骺板損傷的病變進(jìn)程以及治療和預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)4～5周齡Wistar大鼠46只（1只麻醉意外死亡），雌雄不限，體質(zhì)量150±10 g，購(gòu)于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（京）2011-011］。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地： 北京積水潭醫(yī)院屏障動(dòng)物室［SYXK（京）2012-0027］。

1.2儀器、試劑

Micro-CT（Skyscan1172, 產(chǎn)地比利時(shí)）, RM-2235組織切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。甲醛、蘇木素、伊紅等組織切片和染色用試劑購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司，國(guó)產(chǎn)分析純乙醚。

1.3方法

1.3.1大鼠骺板損傷模型建立將大鼠分為3組, 第1組為對(duì)照組，不作處理，正常飼養(yǎng)； 第2組為直接刮除組，直接切除法制作骺板損傷模型； 第3組為手動(dòng)成角組，采用手動(dòng)損傷的方法制作骺板損傷模型。直接刮除組： 大鼠行乙醚麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，右側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨上端前內(nèi)側(cè)逐層縱向切開(kāi)，用無(wú)菌紗布清理傷口，切除脛骨上端前內(nèi)側(cè)骺板，損傷面為總面積的25%～30%，建立骺板損傷模型，生理鹽水沖洗后逐層縫合骨膜及皮膚軟組織。手動(dòng)成角組： 麻醉固定方法同“直接刮除法”，右側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨上端行橫向切口，分離開(kāi)內(nèi)側(cè)副韌帶和軟骨膜，捏持膝關(guān)節(jié)及脛骨，施加外翻應(yīng)力，使骨骺在骺板軟骨水平與干骺端分離呈20～30度角。直視下明確骺板損傷，復(fù)位，生理鹽水沖洗后逐層縫合骨膜及皮膚軟組織。建立脛骨近端Ⅱ型骨骺損傷改良模型。

動(dòng)物分別于術(shù)后4 d、10 d、21 d處死，完整解剖雙側(cè)脛骨，行Micro-CT掃描，CTAn （Comprehensive TeX Archive Network）測(cè)量大體數(shù)據(jù)，之后以體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液固定，行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.2骺板形態(tài)的Micro-CT觀察雙側(cè)脛骨去除附著結(jié)締組織, 將樣本固定在Micro-CT系統(tǒng)的檢測(cè)樣本臺(tái)上, 設(shè)置掃描數(shù)據(jù)，進(jìn)行粗掃描，然后設(shè)置參數(shù)，掃描獲取圖象，掃描完成，調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行2D 及3D的圖形重建。得到脛骨近端冠狀位圖像（此位置圖像顯示最佳）和3D圖像。觀察比較掃描結(jié)果。

1.3.3標(biāo)本的大體測(cè)量以Micro-CT系統(tǒng)自帶的分析軟件CTAn測(cè)得雙側(cè)脛骨長(zhǎng)度、脛骨粗隆寬度、脛腓骨之間最寬距離數(shù)值，做雙側(cè)差值，對(duì)樣本分析處理采集數(shù)據(jù)。

1.3.4標(biāo)本的組織學(xué)觀察Micro-CT掃描后樣本置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛中固定。30% 甲酸脫鈣，石蠟包埋，制備成 4 μm 切片后進(jìn)行HE染色，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1Micro-CT掃描

模型構(gòu)建4 d，與對(duì)照組相比，直接刮除法與手動(dòng)成角法均可見(jiàn)骺板寬度增加，密度欠均勻，骨骺面及干骺面毛糙，呈輕度波浪狀改變，前者還可觀察到內(nèi)側(cè)干骺端處骨質(zhì)缺損，呈干骺端骨折改變，周圍骨質(zhì)密度減低（圖1）。

模型構(gòu)建10 d，與對(duì)照組相比，直接刮除法可見(jiàn)骺板寬度變窄，干骺端骨折處周圍骨小梁稀疏，呈骨質(zhì)疏松改變，有少許骨連接，可能為骨橋。手動(dòng)成角法可見(jiàn)骺板邊界粗糙，骺板寬度增寬，周圍骨質(zhì)密度明顯減低（圖1）。

模型構(gòu)建21 d，與對(duì)照組相比，直接刮除法可見(jiàn)干骺端骨折處出現(xiàn)顯著改變，即骨橋形成，可見(jiàn)骨小梁由干骺端深入骨骺，骺早閉出現(xiàn)。手動(dòng)成角法可見(jiàn)骺板變窄，內(nèi)見(jiàn)細(xì)小新生骨質(zhì)成份，干骺端可見(jiàn)迂曲透亮影, 骨膜反應(yīng)較前減弱（圖1）。

2.2組織學(xué)觀察

模型構(gòu)建4 d，與對(duì)照組相比，直接刮除法可見(jiàn)骺板增寬，內(nèi)側(cè)骺板成分缺失，成熟軟骨細(xì)胞體積增大，兼伴有散在基質(zhì)成分，干骺端骨折區(qū)初級(jí)骨小梁消失。手動(dòng)成角法可見(jiàn)骺板成分缺失，大量散在紅細(xì)胞兼伴有散在基質(zhì)成分（圖2）。

模型構(gòu)建10 d, 與對(duì)照組相比, 直接刮除法骺板損傷區(qū)內(nèi)可見(jiàn)幼稚軟骨細(xì)胞, 干骺端骨小梁稀疏, 基質(zhì)增加。手動(dòng)成角法可見(jiàn)組織細(xì)胞肥大、變性, 骺板軟骨細(xì)胞部分排列紊亂失去柱狀結(jié)構(gòu)（圖2）。

模型構(gòu)建21 d，與對(duì)照組相比，直接刮除法可見(jiàn)骺板損傷區(qū)可見(jiàn)骨性結(jié)構(gòu)，骨小梁由干骺端深入骨骺，骨橋形成，提示骺早閉。手動(dòng)成角法部分區(qū)域可見(jiàn)幼稚軟骨細(xì)胞，干骺端骨小梁稀疏，基質(zhì)增加，部分有骨橋形成（圖2）。

A： 對(duì)照組； B： 直接刮除組； C： 手動(dòng)成角組圖1　動(dòng)物模型Micro-CT掃描表現(xiàn)A： Control group； B： Direct-injury group；C： Manual-rotation groupFigrue 1　Micro-CT scans to assess changes in epiphyseal plate

2.3各時(shí)間點(diǎn)脛骨大體測(cè)量

測(cè)量結(jié)果詳見(jiàn)表1～3。

表 1　各時(shí)間點(diǎn)大鼠脛骨長(zhǎng)度差值比較Table 1　Comparasion of the length of tibia among　different groups in rats　　　　　　　　　　　　　　　　　mm

表 2　各時(shí)間點(diǎn)大鼠脛骨粗隆寬度差值比較Table 2　Comparasion of the width of tibial tuberosity among different groups in rats　　　　　　　　　　　　mm

表 3　各時(shí)間點(diǎn)大鼠脛腓骨之間最寬距離差值比較Table 3　Comparation of the maximal interval between tibia and fibula among different groups in rats　　mm

3　討論

按照Kaul等［6］的提議，在一種動(dòng)物模型中，至少要求具有三種特征，即： 便利、相似、合適。便利指的是容易得到，這是一個(gè)選擇動(dòng)物模型的主要標(biāo)準(zhǔn)；相似是指涉及在動(dòng)物中所研究的現(xiàn)象應(yīng)與人類的有可比性； 合適則要求其它因素的綜合應(yīng)使某一樣本最適合研究某一特殊現(xiàn)象。

目前骺板損傷應(yīng)用的模型動(dòng)物有小鼠、大鼠、兔、豬、犬、牛、羊等。其中最常用來(lái)制備骺板損傷模型的動(dòng)物是4～5周齡的大鼠［7-11］和5～6周齡的新西蘭兔［12,13］, 同時(shí)對(duì)它們幼年的骺板特點(diǎn)和骨骺融合時(shí)間的研究較為詳盡。本實(shí)驗(yàn)將這兩種方法應(yīng)用于大鼠, 大鼠的骺板與人類近似, 且其生命周期短, 可以較快的提供研究結(jié)果。但是模型建成后的影像檢查無(wú)論是X線、CT, 還是MRI檢查就遇到了瓶頸, 檢查部位體積較小會(huì)導(dǎo)致影像質(zhì)量較差, 或者沒(méi)有相對(duì)小的線圈無(wú)法進(jìn)行MRI檢查。Micro-CT的高分辨率正好解決了這個(gè)問(wèn)題［14,15］, 其系統(tǒng)自帶的CTAn分析軟件可以精確的測(cè)量各種數(shù)據(jù)。并且聯(lián)合HE染色對(duì)不同模型制備方法進(jìn)行比較。

在本實(shí)驗(yàn)中直接刮除法損傷骺板累及生長(zhǎng)板軟骨全層，尤其是骺板靜止細(xì)胞層和增殖層，易在骨骺與干骺端之間形成纖維血管橋甚至骨橋，導(dǎo)致骺板的早閉 。Micro-CT和HE染色均顯示能夠良好復(fù)制骺板損傷的病變，成功率高，大體測(cè)量的數(shù)據(jù)方面顯示出現(xiàn)骨短縮、成角等畸形的狀態(tài)較為均一。術(shù)后4 d和10 d，兩種方法沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）； 術(shù)后21 d，直接刮除組數(shù)據(jù)均大于手動(dòng)成角組（P＜0.05）。直接法制備骺板損傷模型為骺板軟骨全層損傷, 缺損較明顯，此動(dòng)物模型雖然與臨床上常見(jiàn)的骺板損傷類型不十分吻合，但具有對(duì)比研究骺板損傷后變化的價(jià)值。而采用手動(dòng)法制備模型, Micro-CT和HE染色均顯示骺板損傷的發(fā)展滯后于直接刮除法，改變不及前者明顯, 這與骺板血運(yùn)屏障是否被破壞有關(guān)。不同術(shù)者在不同時(shí)間, 甚至同一術(shù)者在不同時(shí)間在力量和方向控制上均會(huì)有不同程度的差異。因此, 盡管手動(dòng)成角法與臨床損傷時(shí)所受的外力復(fù)雜情況相近，但缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷木恍?，很難在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一。

綜上所述，在大鼠骺板損傷模型的構(gòu)建上，盡管直接刮除法操作較為復(fù)雜，但具有相對(duì)明確的均一性和穩(wěn)定的造模成功率。因此該方法更利于對(duì)骺板損傷的機(jī)制探討等基礎(chǔ)性研究。

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Comparison on Two Models of Epiphyseal Plate Injury in Rat

JING Jin-zhu1, LI Qing-hai2, LV Xue-min3, LIANG Zhen1, WANG Meng1
（1. Beijing Jishuitan Hospital， Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics， Beijing 100035， China；
2. Tai'an No.1 military subarea sanatorium， Shandong Province， Tai'an 271000， China；
3. Department of Pediatric Orthopedic， Beijing Jishuitan Hospital， 100035 Beijing， China）

ObjectiveTo compare two methods for constructing animal models of epiphyseal plate injury, and therefore to learn more about the disease of epiphyseal plate injury. MethodsFourty-five Wistar rats aged between 4-5 weeks were divided into three groups. Group A was control group, without operation； Group B was direct-injury group, in which the upper part of right tibial epihpyseal plate were cut； Group C was manual-rotation group, in which the knees of rats were grabbed valgusly. The rats were sacrificed after 4, 10 and 21days of operation. Micro-CT scanning and histological assessments were done. The differences between the length of left and right tibia, the width of tuberositas of left and right tibiae, and the minimum distance between tibia and fibula were examined by CTAn（Comprehensive TeX Archive Network） software. ResultsMicro-CT scanning and histological assessments showed that, after 4 days of operation, the width of epiphyseal plate were larger in Group B and Group C, immature chondrocytes were found in Group B, and the bone mineral density around operation site were lower than control in Group B. After 10 days of operation, the epiphyseal plate became narrower in Group B, and the bone mineral density around operation site appeared to be lower than normal in Group C. After 21 days of operation, the bone bridge was found in Group B, and only small new-born sclerotin appeared in Group C. According to the length of tibia, the width of tibial tuberosity, and the maximal interval between tibia and fibula, all of these values in Group B and Group C were significantly higher than Group A （control group） （P＜0.05）； but the values after operation of 21 days of Group B were significantly higher than those of Group B （P＜0.05）, other values were not significantly different between the two groups （P＞0.05）. ConclusionIt is proved that the method of direct-injury is a much better one for constructing rat models of epiphyseal plate injury. This method has good stability and variation which more proper for studying disease of epiphyseal plate injury.

Animal model； Micro-CT； Epiphyseal plate injury

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0351-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.002

2015-01-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題（30750011）

景金珠（1977-）, 女, 碩士, 主管技師, 主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。E-mail： yaoyyy@sohu.com

呂學(xué)敏。E-mail： 914278530@qq.com