大/小鼠組織DNA兩種提取方法的比較

陳雪婷， 郎雪楠， 李兆陽， 張婀娜， 趙　文， 董婉維， 周生來， 張梅英， 鄭志紅

（中國醫(yī)科大學實驗動物部， 沈陽　110001）

大/小鼠組織DNA兩種提取方法的比較

陳雪婷， 郎雪楠， 李兆陽， 張婀娜， 趙文， 董婉維， 周生來， 張梅英， 鄭志紅

（中國醫(yī)科大學實驗動物部， 沈陽110001）

目的獲取質量穩(wěn)定的基因組DNA，快速鑒定模型動物基因型。方法以鼠尾組織為實驗材料，采用苯酚/氯仿法和改良煮沸法提取鼠基因組 DNA； 分別用紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，采用PCR檢測兩種方法獲得DNA的擴增效果。結果酚/氯仿提取法提取的基因組DNA質量優(yōu)于改良煮沸法，但兩種方法獲得的DNA模板均能成功應用PCR擴增進行基因型鑒定，且改良煮沸法DNA提取具有無毒、簡單、高效、便捷的優(yōu)點。結論大批量轉基因大/小鼠基因型鑒定可以優(yōu)先選擇改良煮沸法提取基因組DNA。

DNA提取； PCR； 基因型鑒定

遺傳工程大/小鼠在生命科學領域中越來越多地受到眾多科研人員的青睞，在人類疾病致病分子機制及臨床研究中發(fā)揮著重要的作用［1］。在相關研究中，需要使用大量的遺傳工程動物，因而遺傳工程大/小鼠模型保種及基因型鑒定是后續(xù)試驗順利進行的重要保證。目前，維持一個基因工程大/小鼠品系繁育和保種需要耗費大量人力物力， 因此，建立一個安全、快捷、穩(wěn)定的基因型鑒定體系非常重要。本實驗擬采用苯酚/氯仿法和改良煮沸法兩種方法提取基因組DNA并進行PCR檢測，以期建立一個安全、穩(wěn)定、可靠的的DNA提取技術。

1　材料與方法

1.1實驗動物

2周齡清潔級小鼠10只，大鼠10只，來自本單位［SCXK（遼）2013-0001］［SYXK（遼）2013-0007］。

1.2主要儀器試劑

水浴箱（1003恒溫培養(yǎng)水浴），離心機（SIGMA1-14），分光光度計（NanoDrop 2000c），PCR儀（TakaRa TP350），渦旋機（VORTEX GENIUS 3）電泳儀（DYY-6C），凝膠成像儀（GIS-2008）。

SDS由Biosharp提供； Tris為Sigma公司產品酚: 氯仿: 異戊醇由Solarbil提供； NaCl、NaOH為北京化工廠產品； Proteinase K、PCR反應試劑均為TaKaRa公司產品； Q5超保真DNA聚合酶為Biolabs產品。

1.3DNA裂解液配方

1.3.1苯酚/氯仿法裂解液配方NaCl 2.93 g， 0.5% SDS 2.5 g， 1 mol/L Tris-HCl（pH=0.8） 5 mL， 0.5 mol/L EDTA（pH=8.0） 10 mL，調節(jié)pH值至8.0，定溶至500 mL。

1.3.2改良煮沸法DNA裂解液配方1 mol/L Tris （pH=8.0） 50 mL，0.5 mol/L EDTA 5 mL，20% SDS 5 mL，5 mol/L NaCl 20 mL，定溶至500 mL。取495 μL鼠尾組織裂解液加入5 μL Proteinase K，混勻后，-20℃冷凍保存。

1.4實驗方法

1.4.1苯酚/氯仿法無菌剪尾［2］0.5～1 cm，每個樣本加消化液495 μL，Proteinase K 5 μL， 55 ℃水浴箱中消化過夜，次日加入500 μL Tris 平衡苯酚: 氯仿: 異戊醇（25∶24∶1），實驗操作按照文獻［3］樣本采集符合實驗動物福利與倫理要求。

1.4.2改良煮沸法無菌剪尾0.5～1 cm［4］，每個樣本加入細胞溶解液50 μL（含有Proteinase K）， 55 ℃水浴消化過夜， 置于渦旋機震蕩10 s左右， 加入滅菌去離子水200 μL， 14 000 r/min離心10 min后吸取100 μL上清液至0.2 mL PCR管中， 100 ℃ 加熱10 min，冰水混合物放置5 min，4 ℃保存或用于PCR。

1.5DNA 的質量檢測

1.5.1紫外分光光度計取5 μL DNA加入TE 100倍稀釋［5］，分別測定 DNA 260 nm和280 nm的吸光度值，檢測DNA的濃度和純度。

1.5.2瓊脂糖凝膠電泳法 配制 0.8%瓊脂糖凝膠，取10 μL DNA 上樣，在 0.5×TEB 緩沖液中，電壓 120 V 電泳 30 min， 凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.6PCR擴增反應

1.6.1PCR引物本實驗選用GAPDH、NLRP4E小鼠引物與Tal53-3大鼠引物。引物信息如表1。1.6.2PCR反應體系小鼠GAPDH /大鼠Tal53-3反應體系25 μL: ddH20 18.9 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（50 mol/L）各0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模版1 μL。小鼠NLRP4E反應體系50 μL: ddH20 19.5 μL， 5× Q5 緩沖液10.0 μL， High GC緩沖液10.0 μL，dNTP 4.0 μL， Q5TMHigh-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，上、下游引物（10 mol/L）各2.5 μL， DNA模板1 μL。1.6.3PCR反應條件95 ℃預變性5 min； 94 ℃變性加40 s，退火溫度與延伸時間見表1，共34個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min［6］，4 ℃保存。分別用1% 和2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測兩種方法的擴增產物的濃度與質量。

表1　引物信息

2　結果

2.1DNA濃度

通過分光光度計檢測出苯酚/氯仿法提取大、小鼠DNA的A260/280比值在1.86、1.80左右， 改良煮沸法提取大、小鼠DNA的A260/280比值在1.05、1.10左右，苯酚/氯仿法提取DNA純度較佳（表2、表3）。

2.2瓊脂糖凝膠電泳

通過瓊脂糖凝膠電泳成像可以看到苯酚/氯仿法提取的大、小鼠DNA電泳有彌散現(xiàn)象，但有清楚的DNA條帶，改良煮沸法提取的大、小鼠DNA無明顯條帶，電泳呈彌漫狀態(tài)（圖1、2）。

表2　小鼠DNA 吸光度比較

表3　大鼠DNA 吸光度比較

2.3PCR擴增結果

以兩種方法提取DNA為模板，通過GAPDH、NLRP4E小鼠引物PCR擴增，有清晰的目的條帶（圖3、4）， Tal53-3大鼠引物PCR擴增常規(guī)片段，亦能看到清楚目的條帶（圖5）。

3　討論

建立一個穩(wěn)定的遺傳工程大/小鼠種群，在其繁育過程中基因型鑒定是關鍵環(huán)節(jié)，需要不斷對遺傳工程動物子代進行基因型鑒定，因而，建立一個穩(wěn)定、可靠，快捷、高效的基因組DNA提取方法非常必要。

圖1　小鼠DNA電泳圖

圖2　大鼠DNA電泳圖

圖3　小鼠 GAPDH引物 PCR擴增小片段產物電泳圖

圖4　小鼠NLRP4E引物 PCR擴增大片段產物電泳圖

圖5　大鼠Tal53-3引物PCR擴增常規(guī)片段產物電泳圖

兩種方法提取的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳和 A260/280質量檢測結果比較，苯酚/氯仿法提取的大、小鼠DNA純度較高［7］，雜質少，大、小鼠DNA電泳有清晰條帶，改良煮沸法提取的大、小鼠DNA純度欠佳，大、小鼠DNA電泳條帶呈現(xiàn)彌漫現(xiàn)象，說明提取的基因組DNA片段有少量的斷裂［8］，形成大小不一的片段。苯酚/氯仿法提取的DNA質量優(yōu)于煮沸法。

PCR實驗是轉基因鼠鑒定的最基本也是最重要的技術手段之一，本實驗使用3對引物，以兩種方法提取的基因組DNA為模板，通過PCR擴增產物電泳檢測結果可以看出，兩種方法提取小鼠DNA對大片段與小片段的PCR擴增效果無明顯差異，可以用于常規(guī)目的片段的擴增。兩種方法均可達到鑒定小鼠基因型目的。通過圖5可以看出，大鼠DNA擴增效果與苯酚/氯仿法無明顯差異。此方法同樣適用于大鼠基因型鑒定。

在DNA提取過程中，苯酚/氯仿法DNA提取實驗操作過程需要多次更換EP管和槍頭［9］，提取過程時間較長，主要提取試劑是苯酚、氯仿和異戊醇等有機溶劑，其中苯酚對皮膚、粘膜有強烈的腐蝕作用，氯仿極易揮發(fā)，為可疑致癌物，這幾種化學試劑對人體中樞神經、心、肝、腎功能均有不同程度損傷［10］，如操作不當或長期接觸對實驗人員身體健康具有重大安全隱患。

改良煮沸法DNA提取操作便捷，在提取過程中試劑只使用滅菌去離子水，相對苯酚/氯仿法不僅減少試劑的消耗，并且節(jié)省了大量時間，而且對實驗人員身體無危害，降低了實驗成本和工作量，提取后可馬上用于PCR檢測，檢測結果也較為理想，具有高效、耗時短、安全等優(yōu)勢。

綜上所述， 改良煮沸法提取DNA操作簡單， 耗時少， PCR擴增結果可靠，可用于大批量轉基因大/小鼠基因型鑒定，是一種比較實用的提取方法。

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Q95-33

B

1674-5817（2015）04-0311-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.011

2015-05-31

遼寧省科技計劃項目（2011408004）

陳雪婷（1987-）， 女， 助理實驗師。

E-mail: 552048949@qq.com

鄭志紅。E-mail:zhihongzheng@163.com