美洲旱獺感染實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)管理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)探討

薛康寧， 李曉燕， 李利利， 張賀源， 盧選成

（1. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 北京 102206；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所， 北京　102206）

美洲旱獺感染實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)管理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)探討

薛康寧1， 李曉燕1， 李利利2， 張賀源1， 盧選成1

（1. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 北京 102206；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所， 北京102206）

現(xiàn)代生命科學(xué)研究對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求越來(lái)越廣泛、嚴(yán)格、多樣化［1］， 從用標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做研究發(fā)展到利用特殊的實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物， 從用已經(jīng)人工馴化的動(dòng)物發(fā)展到利用野生動(dòng)物。美洲旱獺（Marmota monax，woodchuck）在感染“美洲旱獺肝炎病毒”（woodchuck hepatitis virus， WHV）后會(huì)出現(xiàn)一些與人感染肝炎病毒后非常相似的臨床癥狀， 包括亞臨床癥狀或一過(guò)性感染、慢性感染癥狀、以及肝癌， 因此美洲旱獺是評(píng)價(jià)針對(duì)肝炎病毒治療性疫苗的理想模型［2］， 而建立美洲旱獺飼養(yǎng)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)并規(guī)范化，是開展所有研究工作的前提和基礎(chǔ)， 本文就美洲旱獺甲型肝炎病毒感染實(shí)驗(yàn)中涉及到的飼養(yǎng)管理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行探討， 以期為相關(guān)研究提供參照。

1　美洲旱獺飼養(yǎng)管理

1.1美洲旱獺的生物學(xué)特性

美洲旱獺，俗稱土撥鼠，屬嚙齒目（Rodentia）松鼠科（Sciuridae）旱獺屬（Marnota）， 是松鼠科動(dòng)物中體型最大的一種［3］。近年來(lái)應(yīng)用旱獺制作人類疾病的動(dòng)物模型研究越來(lái)越多［4，5］。深入了解旱獺的生物學(xué)特性，掌握旱獺的飼養(yǎng)管理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是開展相關(guān)研究的重要保證。

1.1.1生物學(xué)特性及相應(yīng)的飼養(yǎng)要求旱獺為穴居動(dòng)物，洞穴是旱獺冬眠、繁殖、過(guò)夜、避敵、休息、玩耍的共用場(chǎng)所［3］。因此在旱獺的飼養(yǎng)過(guò)程中需要給旱獺提供一個(gè)干燥清潔，光照強(qiáng)度較弱的飼養(yǎng)環(huán)境。旱獺耐饑餓，不飲水，喜歡食入帶有露水的草［3］，因此在旱獺的飼養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)提供適當(dāng)?shù)男迈r蔬菜，如圓白菜等，來(lái)為旱獺提供必需的水分及纖維素等營(yíng)養(yǎng)。

1.1.2旱獺飼料要求旱獺為草食性動(dòng)物， 凡牛、羊、兔采食的飼料均可作為旱獺的飼料［3］。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)美洲旱獺飼喂由北京市科奧協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的兔生長(zhǎng)繁殖飼料， 主要營(yíng)養(yǎng)成分: 粗蛋白18.93%，粗脂肪3.04%，粗纖維10.52%，水分7.98%。

1.2風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室內(nèi)安全開展實(shí)驗(yàn)的重要前提， 是實(shí)驗(yàn)室采取風(fēng)險(xiǎn)控制措施、建立安全管理體系和制定安全操作規(guī)程的依據(jù)［6］。將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的內(nèi)容及時(shí)告知實(shí)驗(yàn)人員及工作人員可大大加強(qiáng)生物風(fēng)險(xiǎn)的防控力度， 避免出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室感染事件。

本次感染實(shí)驗(yàn)的病原微生物為甲型肝炎病毒（HAV），按照加拿大公共衛(wèi)生署官方網(wǎng)站提供的病原體安全資料表及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（pathogen safety data sheets and risk assessment）中關(guān)于甲型肝炎病毒的內(nèi)容對(duì)本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［7］:

1.2.1病原介紹特性: 甲型肝炎病毒屬于小核糖核酸病毒科， 肝病毒屬，二十面體結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜，已鑒定出7種基因型（I～VII）； 致病性: HAV只會(huì)引起急性肝炎，與慢性肝炎病毒并無(wú)關(guān)系，大多數(shù)被感染者并不表現(xiàn)出特異性臨床癥狀，伴有胃腸道癥狀，病程通常少于2個(gè)月，在極少數(shù)情況下，HAV能引起嚴(yán)重的癥狀，導(dǎo)致患者死亡。宿主范圍: 人類，黑猩猩以及其他非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物例如狨猴、絹毛猴、梟猴、松鼠猴也對(duì)HAV易感。感染劑量: 未知。傳播途徑: 通常為糞口傳播，最常報(bào)道的HAV感染來(lái)源是家庭內(nèi)，或與其他被感染人員的接觸， 其他潛在的感染途徑包括性傳播， 在HAV流行國(guó)家旅行，以及非法使用受污染的藥物與針頭，罕見通過(guò)食入或飲入受感染的食物或飲水傳播的情況，通過(guò)輸血或使用血液制品進(jìn)行傳播的情況更加罕見。潛伏期: 平均為28～30 d（最短為15 d， 最長(zhǎng)為50 d）。傳染性: 在潛伏期的后半段時(shí)間傳染性最強(qiáng)，并且在出現(xiàn)黃疸后持續(xù)幾天強(qiáng)的傳染性。不會(huì)出現(xiàn)糞便長(zhǎng)期排毒的情況。穩(wěn)定性與存活力: 1%次氯酸鈉可滅活甲肝病毒，85℃，1 min即可滅活，病毒離開宿主后在室溫下或酸性條件下極其穩(wěn)定，這樣可以保證病毒在環(huán)境中存活，并且可以通過(guò)受污染的食物或飲水來(lái)傳播。

1.2.2治療藥物及預(yù)防 還未發(fā)現(xiàn)對(duì)甲肝的有效特異性治療，建議臥床休息，均衡營(yíng)養(yǎng)，避免飲酒及其他損肝毒物； 暴露于HAV病毒的人員應(yīng)在兩周之內(nèi)接受HAV免疫球蛋白注射（0.02 mL/kg體質(zhì)量），對(duì)于實(shí)驗(yàn)室工作人員，在暴露之前注射滅活HAV疫苗可有效預(yù)防。

1.2.3實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)室的樣本來(lái)源為被感染人員或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的糞便，其他來(lái)源還包括血液，肝組織以及膽汁； 主要危險(xiǎn)來(lái)源為注射帶有HAV病毒生物樣本（糞便、血液）或者間接接觸被污染環(huán)境的表面。

1.2.4防范措施實(shí)驗(yàn)中的個(gè)人防護(hù)應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)服，手套及護(hù)目鏡，所有可能產(chǎn)生氣溶膠、高濃度或大量病毒的操作都應(yīng)在BS48內(nèi)進(jìn)行，嚴(yán)格限制使用利器。

1.2.5實(shí)驗(yàn)廢品處置 所有相關(guān)材料用化學(xué)消毒液或蒸汽高壓鍋進(jìn)行消毒，或者進(jìn)行焚燒。

1.3動(dòng)物來(lái)源、動(dòng)物接收及人員的防護(hù)

雄性美洲旱獺6只，1～3歲，體質(zhì)量3.0 kg左右，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源北方中心。

整個(gè)動(dòng)物接收過(guò)程需有獸醫(yī)、動(dòng)物供應(yīng)商及實(shí)驗(yàn)人員三方共同在場(chǎng)確認(rèn)。動(dòng)物的接收、大體檢查及傳入等工作需詳細(xì)記錄在《動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接收、檢疫記錄表》中，表的主要內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)人員聯(lián)系方式，動(dòng)物接收時(shí)間，動(dòng)物品種、品系及級(jí)別，接收動(dòng)物的數(shù)量、性別、日齡或體質(zhì)量，供應(yīng)商信息、動(dòng)物運(yùn)輸方式、運(yùn)輸條件、動(dòng)物質(zhì)量合格證的編號(hào)、動(dòng)物運(yùn)輸包裝的完整性、傳入屏障區(qū)的房間號(hào)、房間負(fù)責(zé)人、傳入屏障區(qū)的方式及傳入人和獸醫(yī)檢查結(jié)果描述等信息。運(yùn)輸此美洲旱獺的運(yùn)輸籠具為木制運(yùn)輸箱箱內(nèi)存放有墊料及飲水，保證動(dòng)物在運(yùn)輸過(guò)程中的舒適度。接收工作結(jié)束后，獸醫(yī)需對(duì)新進(jìn)動(dòng)物進(jìn)行原位檢疫。

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的內(nèi)容，個(gè)人防護(hù)應(yīng)穿戴實(shí)驗(yàn)服、手套、醫(yī)用口罩、護(hù)目鏡，特別是為了防止動(dòng)物抓傷咬傷，操作人員還需穿戴防咬手套。

1.4屏障設(shè)施內(nèi)籠具飼養(yǎng)

飼養(yǎng)籠具及飼養(yǎng)房間在接收旱獺之前用1∶600濃度稀釋的百毒殺進(jìn)行噴霧消毒，待籠具干燥方可將旱獺放入。本次實(shí)驗(yàn)中使用的籠具為生物安全負(fù)壓實(shí)驗(yàn)犬猴飼養(yǎng)系統(tǒng)籠具（圖1）（美國(guó)Rockvill Steel& Manufacturing公司開發(fā)制造，6.0 Bio-Containment Module#1C-A4BC，PLC型）。該型號(hào)的負(fù)壓抽吸系統(tǒng)，特別用于確保預(yù)設(shè)負(fù)壓下的風(fēng)機(jī)變速，確保動(dòng)物籠內(nèi)負(fù)壓大于等于10 Pa，可以防止病原微生物的外泄，保證動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施內(nèi)的生物安全。每個(gè)籠的大小為15.5立方英尺?；\具配備有鎖式拉門、擠壓板。采取每籠單只飼養(yǎng)模式。

1.5飼料及飼喂頻率

結(jié)合美洲旱獺供應(yīng)方飼養(yǎng)人員的經(jīng)驗(yàn)，確定每日9∶00、15∶00定時(shí)飼喂。分別供給新鮮圓白菜50 g，兔飼料30 g，新鮮花生5 g。

1.6飼養(yǎng)間環(huán)境

飼養(yǎng)間內(nèi)溫度控制在22～26℃，相對(duì)濕度控制在40%～60%，光照為睡眠燈與黑暗8 h更換。飼養(yǎng)間的通風(fēng)頻率穩(wěn)定在15次/h。

圖1　飼養(yǎng)美洲旱獺籠具

2　美洲旱獺實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)

2.1動(dòng)物的抓取和保定

采用籠具保定法，即通過(guò)籠具擠壓板縮小旱獺所處的空間，使其身體被固定在擠壓板和籠具正面的狹小空間內(nèi)，使其無(wú)法自由活動(dòng)，以達(dá)到保定的效果。無(wú)需人工抓取，即可完成后肢肌肉注射麻醉劑的操作。

2.2動(dòng)物標(biāo)記

單只飼養(yǎng)，采用籠具插標(biāo)簽編號(hào)法。標(biāo)簽可置于籠位外表，包含的信息有實(shí)驗(yàn)名稱，動(dòng)物進(jìn)駐時(shí)間，實(shí)驗(yàn)人員聯(lián)系方式，動(dòng)物體質(zhì)量，日齡，以及動(dòng)物編號(hào)等。

2.3實(shí)驗(yàn)操作前麻醉方法的確定

參照文獻(xiàn)中推薦的麻醉藥品及麻醉方法，即選用鹽酸氯胺酮進(jìn)行后肢肌肉注射，達(dá)到全身麻醉的效果，按照15 mg/kg、45 mg/kg、99 mg/kg體質(zhì)量計(jì)算用藥量，3種注射劑量均有效［8］。本次實(shí)驗(yàn)采用了45 mg/kg 體質(zhì)量的給藥量， 顯效時(shí)間為1～3 min，麻醉維持時(shí)間為20～40 min，之后美洲旱獺從抑制狀態(tài)逐漸恢復(fù)， 1 h完全恢復(fù)正常狀態(tài)。

2.4給藥途徑與方法

本實(shí)驗(yàn)給藥途徑為后肢內(nèi)側(cè)皮下小隱靜脈注射給藥，一次給藥量為1.0 mL。

2.5血液采集

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)人員需要的采血量， 采用5 mL注射器在后肢內(nèi)側(cè)皮下小隱靜脈采集血液，一次可采集2～5 mL。

2.6實(shí)驗(yàn)后護(hù)理

實(shí)驗(yàn)操作后，應(yīng)待美洲旱獺完全蘇醒后方可將旱獺送回原籠位，側(cè)身臥位，保證旱獺呼吸通暢，飼養(yǎng)間的溫度保持在22～26 ℃。確保旱獺得到充分休息和足夠營(yíng)養(yǎng)。獸醫(yī)人員應(yīng)密切關(guān)注動(dòng)物狀態(tài)，及時(shí)進(jìn)行護(hù)理措施。

2.7動(dòng)物安死術(shù)

本次實(shí)驗(yàn)采用深度麻醉與心臟采血相結(jié)合的方法對(duì)美洲旱獺施行安死術(shù)。具體操作為使用鹽酸氯胺酮對(duì)美洲旱獺進(jìn)行麻醉，用藥量為99 mg/kg體質(zhì)量。之后在負(fù)壓解剖臺(tái)上將旱獺仰臥保定，用注射器在心臟搏動(dòng)最明顯處進(jìn)針采血，直至動(dòng)物心跳呼吸停止為止。由于實(shí)驗(yàn)為甲型肝炎病毒的感染性實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物尸體表面以及排泄物應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉進(jìn)行充分噴灑消毒，之后將動(dòng)物尸體及其他廢棄物分別裝入醫(yī)療垃圾袋中封口，交由相關(guān)人員進(jìn)行處理。

3　體會(huì)

美洲旱獺尚未成為我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，有其特殊性。飼養(yǎng)過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)都需經(jīng)過(guò)實(shí)踐摸索，得到經(jīng)驗(yàn)。經(jīng)人工馴養(yǎng)的美洲旱獺仍具有野外生存的特性，如兇猛，攻擊性強(qiáng)等，這就需要研究人員在飼養(yǎng)籠具、飲食、實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作、人員安全防護(hù)等方面不斷探索，以總結(jié)出適合美洲旱獺飼養(yǎng)管理及實(shí)驗(yàn)操作的特定技術(shù)經(jīng)驗(yàn)。

對(duì)于在2級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施內(nèi)開展的感染性實(shí)驗(yàn)，一定要注意風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作的進(jìn)行。確保參與到感染性實(shí)驗(yàn)的每個(gè)人員熟知各項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素，將風(fēng)險(xiǎn)程度降至最低。

［1］于海英， 辛淑芳， 王曉寧， 等. 國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)發(fā)展動(dòng)態(tài)［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志， 1999， 9（3）:1-4.

［2］Roggendorf M，Yang D， Lu M. The woodchuck: A model for therapeutic vaccination against hepadnaviral infection ［J］. Pathol Biol （Paris）， 2010， 58（4）:308-314.

［3］王山西. 旱獺人工養(yǎng)殖技術(shù)［J］. 農(nóng)村實(shí)用技術(shù)， 2006， 4:56-57.

［4］范薇， 王忠東， 陶元清. 青海省野生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究進(jìn)展［J］. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理， 1997， 14（4）:60-63.

［5］李菁菁， 陳乾生. 病毒性肝炎動(dòng)物模型的研究［J］. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理， 1995， 12（3）:29-32.

［6］薛康寧， 李曉燕， 榮蓉， 等. 動(dòng)物生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)活動(dòng)管理要點(diǎn)探討［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)， 2014， 31（5）:42-45.

［7］http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/hepa-eng. php#footnote1［DB/OL］.

［8］范薇. 喜馬拉雅旱獺制動(dòng)性麻醉方法［J］. 四川動(dòng)物， 2008，27（6）:1139-1140.

Q95-33

C

1674-5817（2015）04-0320-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.014

2015-05-31

十二五科技重大專項(xiàng)（No.2012ZX10004-404）

薛康寧（1986-）， 女， 研究實(shí)習(xí)員， 碩士， 從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獸醫(yī)工作。E-mail: Xuekn@chinacdc.cn

盧選成（1977-）， 男， 副研究員， 從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理工作。E-mail: luxc@chinacdc.cn