SD大鼠超數(shù)排卵的優(yōu)化

張婀娜， 郎雪楠， 趙　文， 陳雪婷， 董婉維， 周生來， 于　洋， 王　惟， 張梅英， 鄭志紅

（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部　遼寧省轉(zhuǎn)基因研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 沈陽　110001）

·經(jīng)驗(yàn)交流·

SD大鼠超數(shù)排卵的優(yōu)化

張婀娜， 郎雪楠， 趙文， 陳雪婷， 董婉維， 周生來， 于洋， 王惟， 張梅英， 鄭志紅

（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部遼寧省轉(zhuǎn)基因研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 沈陽110001）

目的通過對鼠齡及激素劑量的控制研究其對SD 大鼠排卵的影響。方法分別采用三種不同劑量PMSG/hCG組合（PMSG/hCG:20 IU/20 IU、25 IU/25 IU、30 IU/30 IU）對4、5、6周齡的SD 大鼠進(jìn)行超數(shù)排卵處理，以超數(shù)排卵總卵數(shù)、正常受精卵數(shù)、異型卵數(shù)作為評判標(biāo)準(zhǔn)，確定最佳超排劑量及鼠齡。結(jié)果20 IU劑量時(shí)，三種周齡大鼠分別獲取胚胎 24.72枚、33.12枚、15.22枚，其中正常受精卵:21.58枚、29.1枚、13.1枚，異型卵: 2.01枚、1.01枚、2.12枚； 25 IU劑量時(shí)，三種周齡大鼠分別獲取胚胎37.63枚、43.62枚、20.78枚，其中正常受精卵22.67枚、38.6枚、18.5枚，異型卵: 2.82枚、1.23枚、2.28枚； 30 IU劑量時(shí)，三種周齡大鼠分別獲取胚胎51.69枚、61.36枚、30.2枚，其中正常受精卵47.2枚、60.8枚、25.6枚， 異型卵: 1.23枚、0.56枚、1.3枚。結(jié)論5周齡，激素劑量30 IU為大鼠超排的最適周齡及最佳激素劑量，為基因工程動(dòng)物制備及胚胎冷凍實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)保障。

超數(shù)排卵； 激素； 周齡； SD大鼠

從基因工程小鼠出現(xiàn)至今，其對于基因功能的闡釋及人類疾病發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)揮了巨大的作用。但是隨著Talens、CRISPR/CAS9 技術(shù)的突破與完善，大鼠因其自身的生理學(xué)特性，其應(yīng)用也越來越廣泛。SD 大鼠是國際上通用的大鼠品系，遺傳背景明確，具有獨(dú)特的生理學(xué)特性，在轉(zhuǎn)基因及基因敲除動(dòng)物制備中廣為使用。

與小鼠相比，大鼠的遺傳操作起步較晚且仍需完善，大鼠排卵仍存在個(gè)體差異明顯、受精率低、胞質(zhì)抗損傷能力差等諸多問題。超數(shù)排卵獲得大量優(yōu)質(zhì)胚胎是制備轉(zhuǎn)基因及基因敲除動(dòng)物的前提和基礎(chǔ)［1］，關(guān)于SD大鼠超數(shù)排卵程序尚不完善，胚胎回收率與可用胚胎數(shù)仍不夠穩(wěn)定，分析原因主要與大鼠周齡和超數(shù)排卵劑量有關(guān)。本研究通過對不同周齡SD大鼠給予不同劑量的激素研究這些因素對大鼠超數(shù)排卵的影響，以獲得最佳的超數(shù)排卵條件， 為制備基因工程動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 4、5、6周齡清潔級雌性SD大鼠各30只，雄性SD大鼠90只，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（京）2012-0001］， 分別單籠飼養(yǎng)在清潔級動(dòng)物房，溫度23±2℃， 自動(dòng)光控（光照時(shí)間7∶00-19∶00）［SYXK（遼）2013-0007］。

礦物油（胚胎級）、M2培養(yǎng)液、透明質(zhì)酸酶均為Sigma公司產(chǎn)品，孕馬血清促性腺激素（PMSG）為寧波市三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，人絨毛膜促性腺激素（hCG）為麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠產(chǎn)品。體視顯微鏡（OLympus）、CO2培養(yǎng)箱（Galaxy S）等。

1.2大鼠分組

將所選的4、5、6周齡雌鼠按周齡隨機(jī)分為9組，每組10只。

1.3超數(shù)排卵

1～3組、4～6組、7～9組分別于下午15∶00注射PMSG 20 IU、25 IU、30 IU，48 h后注射相同劑量的hCG， 注射hCG后雌鼠與同品系雄鼠按照1∶1的比例合籠。次日清晨檢出帶有陰栓的雌性大鼠。

1.4培養(yǎng)基準(zhǔn)備

采卵的前1 d下午16∶00，用mR1ECM培養(yǎng)液制作培養(yǎng)碟，石蠟油覆蓋，放入37.0℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

1.5采卵碟的準(zhǔn)備

采卵當(dāng)日早上8∶00，用小型培養(yǎng)皿做采卵碟（M2培養(yǎng)液覆蓋石蠟油），放入37.0 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。

1.6取卵

采用頸椎脫位法處死見栓的大鼠，收集輸卵管，用自制灌流針在實(shí)體解剖鏡下將受精卵從輸卵管傘部輕輕吹出，清洗3～5次后移入胚胎培養(yǎng)液并記數(shù)卵的數(shù)量，將其置于37.0 ℃ 體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中。在鏡下分別統(tǒng)計(jì)總卵數(shù)、正常受精卵數(shù)（判斷標(biāo)準(zhǔn)為: 排出第二極體并有兩個(gè)原核胞質(zhì)均勻無異常卵裂）和異型卵數(shù)量（判斷標(biāo)準(zhǔn): 胚胎無可見原核，注射前異常卵裂，胚胎體積明顯小于正常胚胎）。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）的形式表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

總卵數(shù)及正常受精卵數(shù)5周齡多于4周齡和6周齡（P＜0.05），異型卵數(shù)5周齡少于4周齡和6周齡（P＜0.05）； PMSG/hCG組合30 IU/30 IU 劑量時(shí)所獲得的總卵數(shù)和正常受精卵數(shù)均比20 IU/20 IU和25 IU/25 IU多（P＜0.05），異型卵數(shù)比20 IU/20 IU 和25 IU/25 IU少（P＜0.05）（表1）。

表1　不同周齡SD大鼠超排卵數(shù)

3　討論

原核顯微注射是制備基因工程動(dòng)物最常用的技術(shù)手段之一，而原核顯微注射的效率并不高，只有5%～30%，因此獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)胚胎是制備基因工程動(dòng)物的必要條件之一。建立穩(wěn)定有效的大鼠超數(shù)排卵方案，對于最終獲得基因工程大鼠尤為重要［2］。

哺乳動(dòng)物雌體一生產(chǎn)生的卵子總數(shù)是在其胚胎發(fā)育形成卵巢的過程中確定的，成熟的卵子在哺乳動(dòng)物成年后的發(fā)情周期中分別排出。為了獲得最大數(shù)量的卵母細(xì)胞，通常采用超數(shù)排卵的方法，用外源激素處理雌性動(dòng)物，改變其性周期，使之按照預(yù)定時(shí)間超常量的排卵，以此降低成本，提高繁殖效率［3］。然而，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系、品種、動(dòng)物年齡與生殖健康狀態(tài)、激素使用劑量、PMSG 和hCG 注射時(shí)間及其間隔時(shí)間等多種因素均會(huì)影響超數(shù)排卵效果［4］。有文獻(xiàn)報(bào)道［5］，激素用量并不與超數(shù)排卵數(shù)量呈正相關(guān)， 激素劑量過低， 外源激素不能滿足較多卵母細(xì)胞發(fā)育的需要，對動(dòng)物起不到超數(shù)排卵的作用； 激素劑量過高，影響了卵子的運(yùn)行速度而導(dǎo)致卵母細(xì)胞排放率下降，反而抑制排卵部分卵子殘留在卵泡中不能排出導(dǎo)致卵巢囊腫。

本實(shí)驗(yàn)以前人研究［6］為基礎(chǔ)，結(jié)合本單位自身技術(shù)優(yōu)勢［7］，在保證動(dòng)物質(zhì)量、環(huán)境因素相同的情況下對其激素劑量和動(dòng)物周齡進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較其排卵數(shù)、正常受精卵數(shù)以及異型卵數(shù)，從而探索最佳的超數(shù)排卵條件。通過表1可見: 6周齡大鼠排卵均比4、5周齡少，所以6周齡大鼠不適合超數(shù)排卵； 30 IU劑量組得到的總卵數(shù)和正常受精卵最多，所以此劑量組為最適合的超數(shù)排卵劑量； 5周齡時(shí)異型卵數(shù)最少，所以5周齡為最合適的超數(shù)排卵周齡。超數(shù)排卵是極其復(fù)雜的生理過程， 其影響因素很多， 本文僅針對不同劑量、不同周齡進(jìn)行了初步探討研究， 得出以下結(jié)論: 30 IU的PMSG+hCG組合超數(shù)排卵效果優(yōu)于20 IU和25 IU； 5周齡大鼠超數(shù)排卵效果優(yōu)于4和6周齡大鼠。因此，判定SD大鼠的超數(shù)排卵以PMSG/hCG 30IU劑量組合、5周齡效果最好。

［1］卞洲艷， 楊政， 徐蔓， 等. SD大鼠超排及TALEN質(zhì)粒顯微注射構(gòu)建基因敲除大鼠［J］. 海南醫(yī)學(xué)， 2013， 24（21）:3121 3125.

［2］ 衛(wèi)曉弈， 章蓉， 金宇娟， 等. 轉(zhuǎn)基因SD大鼠構(gòu)建技術(shù)的研究［J］. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 30（1）:26-30.

［3］宋遠(yuǎn)征， 王怡， 王寶珠， 等. 激素劑量、小鼠品系及周齡對超數(shù)排卵的影響［J］. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)， 2011， 28（4）:6-8.

［4］戴麗軍， 黃月玲， 葉炳飛 C57BL/6J小鼠超排卵的研究［J］中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2003， 11（1）:51-53.

［5］邱澤文， 姜午旗， 高麗波， 等. 不同激素劑量和組合對不同品系小鼠超數(shù)排卵的影響［J］. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)， 2011， 15（53）:9977-9980.

［6］周生來， 于洋， 王維， 等. SD大鼠超排卵及胚胎冷凍方法比較［J］. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志， 2008， 28（6）:398-400.

［7］鄭志紅， 楊蕆， 周生來， 等. 激肽釋放酶轉(zhuǎn)基因大鼠模型的建立［J］. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志， 2007， 17（8）:463-466.

Q95-33

B

1674-5817（2015）04-0316-02

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.012

2015-05-31

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013408001）

張婀娜（1988-）， 女， 本科， 助理實(shí)驗(yàn)師。E-mail: 731219482@qq.com

鄭志紅， 教授。E-mail: zhihongzheng@163.com