化橘紅中主要活性成分對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

董晶，肖移生，陳海芳，羅小泉，黃佩蓓，裴 昆，易徐航，楊武亮

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化橘紅中主要活性成分對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

董晶1，肖移生2，陳海芳1，羅小泉1，黃佩蓓2，裴 昆1，易徐航1，*楊武亮1

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西，南昌330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西，南昌330004）

目的 初步觀察化橘紅中主要活性成分對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。方法 通過原代培養(yǎng)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞，采用MTT法觀察化橘紅中主要活性成分柚皮苷（Naringin）、橘皮內(nèi)酯（Meranzin）和水合橘皮內(nèi)酯（Meranzin hydrate）對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 柚皮苷（0.2 ~2.0 mg/mL）對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用（< 0.01），水合橘皮內(nèi)酯（0.1 ~1.0 mg/mL）對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（< 0.01），橘皮內(nèi)酯（0.05 ~ 0.5 mg/mL）對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞的增殖作用不明顯（＞0.05）。結(jié)論 柚皮苷與水合橘皮內(nèi)酯可能是化橘紅主要藥效活性成分。

化橘紅；活性成分；豚鼠支氣管平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞增殖

化橘紅為蕓香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，具有理氣寬中、燥濕化痰的功效，用于咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶[1]?；偌t因其常單味入藥，其藥效研究目前多集中在總提取物[2]、化橘紅總黃酮[3-4]及多糖部位[5-9]。實(shí)驗(yàn)大多采用小鼠、大鼠的酚紅排泌量法[9-10]，或小鼠氨水、豚鼠枸櫞酸引咳實(shí)驗(yàn)[9-10]，以及采用豚鼠離體平滑肌[2]等研究方法，以觀察與化橘紅中醫(yī)臨床功效主治相吻合的藥效部位或活性成分。但化橘紅中各主要化學(xué)成分的藥效作用仍不明，且對(duì)其所含主要成分藥效觀察少見報(bào)道。本研究擬采用MTT法觀察化橘紅中主要活性成分柚皮苷、橘皮內(nèi)酯和水合橘皮內(nèi)酯對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，為下一步找尋化橘紅中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

化橘紅主要單體成分（柚皮苷、橘皮內(nèi)酯、水合橘皮內(nèi)酯）均自制（純度> 98%）；DMEM培養(yǎng)基（Solarbio公司，批號(hào)：20140326）；四甲基偶氮唑鹽MTT（Solarbio公司）；青鏈霉素混合液（100X）（Solarbio公司，批號(hào)：20131218）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）（Solarbio公司，批號(hào)：20120725）；D-Hanks平衡鹽粉劑（無酚紅）（Leagene，批號(hào)：0425A14）；無支原體胎牛血清（FBS，四季青，批號(hào)：120716）；二甲基亞砜（DMSO，天津福晨化學(xué)試劑，批號(hào)：20120712）。

1.2 主要儀器

潔凈工作臺(tái)（蘇潔凈化，100級(jí)）、顯微鏡（XDS-1B）、離心機(jī)H-1650、細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO MCO-175）、手術(shù)器械一套、酶標(biāo)儀（BioTek ELx800，Gene Company Limited）。

1.3 動(dòng)物

豚鼠(上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司)，150 g ± 50 g，雌雄兼有，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0007。

1.4 方法

1.4.1 豚鼠氣管平滑肌的獲取與培養(yǎng)[11]

原代培養(yǎng)：取幼年豚鼠，木棒猛擊頭部致暈，75％乙醇浸洗全身，無菌條件下剪開頸部，取出自氣管隆突至支氣管分叉處的一段氣管。D-Hanks液漂洗3遍，縱行剪開氣管，剝離上皮、結(jié)締組織、血管后，移入另一加有少量DMEM(含15％FBS)的培養(yǎng)皿中，用虹膜剪將氣管剪成1 mm3的小塊。將組織塊移入培養(yǎng)瓶(50 mL)中，陣狀排列，使其均勻分布于培養(yǎng)瓶底部，并將培養(yǎng)瓶倒置輕放于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中。16～18 h后當(dāng)組織塊邊緣輕微干涸而粘牢于瓶壁時(shí)，沿培養(yǎng)瓶頸緩緩滴入3 mL含15％FBS的DMEM培養(yǎng)基，使組織塊完全浸泡于培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。每3d換液1次，5~8 d后可見細(xì)胞自組織塊周圍長(zhǎng)出，兩周后細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁，呈輻射狀向四周生長(zhǎng)，細(xì)胞多成梭形或長(zhǎng)菱形，組織塊周圍細(xì)胞密度增大，呈現(xiàn)“峰—谷”狀。

傳代培養(yǎng)：兩周后培養(yǎng)的氣管平滑肌細(xì)胞融合，局部疊加生長(zhǎng)密度較大，這時(shí)需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。D-Hanks液漂洗2遍，再加入胰蛋白酶-EDTA消化液覆蓋整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)面，作用1 min后在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞質(zhì)回縮、胞間間隙增大時(shí)終止消化。迅速吸出消化液，加入含15％FBS的DMEM培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)輕輕吹打瓶壁，使貼壁細(xì)胞懸浮。收集細(xì)胞懸液于經(jīng)滅菌的離心管中，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，向沉淀中加入10~15 mL含15％FBS的DMEM培養(yǎng)液，以1:2的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中，每3 d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底的80％時(shí)繼續(xù)傳代。

1.4.2 MTT法測(cè)定[12-13]

實(shí)驗(yàn)分別設(shè)調(diào)零孔、對(duì)照孔、加藥孔。測(cè)量時(shí)將配置好的MTT溶液(5 mg/mL)，每孔10 μL加入96孔板，避光操作，于培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h后出現(xiàn)藍(lán)色晶體，移液槍棄去每孔液體后加入100 μL DMSO，搖床5 min至藍(lán)色晶體全部溶解，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔的OD值。因活性細(xì)胞的數(shù)量與490 nm處的OD值成正比，所以計(jì)算豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞的增殖率：

1.4.3 給藥方案

配制各單體成分（柚皮苷、橘皮內(nèi)酯、水合橘皮內(nèi)酯）的母液，過濾除菌，臨用前用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的供試液。每組分別設(shè)調(diào)零組（培養(yǎng)液+助溶劑DMSO）、對(duì)照組（細(xì)胞懸液+培養(yǎng)液+DMSO）以及給藥各濃度組。以1×105個(gè)/mL的密度接種細(xì)胞板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每組平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)化橘紅中主要單體成分柚皮苷、橘皮內(nèi)酯、水合橘皮內(nèi)酯對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行了考察，通過MTT法比較各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異性，并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的增殖率，其結(jié)果見表1~表3。

表1 柚皮苷對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組比較**< 0.01

表2水合橘皮內(nèi)酯對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

Table 2 Effect of Meranzin hydrate on guinea pig tracheal smooth muscle cells proliferation

注：與對(duì)照組比較**< 0.01

表3 橘皮內(nèi)酯對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

3 討論

化橘紅是中醫(yī)臨床常用中藥，具有理氣寬中、燥濕化痰的功效，且常單味入藥，其主要含有柚皮苷、水合橘皮內(nèi)酯、橘皮內(nèi)酯和多糖等成分，其與中醫(yī)臨床功效主治相吻合的活性成分及其藥效作用機(jī)制有待進(jìn)一步考察。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：柚皮苷(0.2 ~2 mg/mL)對(duì)豚鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用(< 0.01)；水合橘皮內(nèi)酯(0.1 ~1 mg/mL)對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(< 0.01)；橘皮內(nèi)酯(0.05 ~0.5 mg/mL)對(duì)細(xì)胞增殖作用不明顯(> 0.05)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)初步表明柚皮苷與水合橘皮內(nèi)酯可能是化橘紅化痰作用的活性成分，可為下一步動(dòng)物離體組織試驗(yàn)和在體試驗(yàn)提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用豚鼠氣管平滑肌組織塊原代培養(yǎng)方法，與酶消化原代培養(yǎng)的方法[14-15]相比，僅需加入胰蛋白酶，不需添加膠原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白等，因而此法簡(jiǎn)便而經(jīng)濟(jì)。

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Effects of the main active components in Exocarpium on the proliferation of tracheal smooth muscle cells in guinea pig

DONG Jing1, XIAO Yi-sheng2, CHEN Hai-fang1, LUO Xiao-quan1, HUANG Pei-bei2, PEI Kun1, YI Xu-hang1,*YANG Wu-liang1

(1. Key Laboratory of Modern Preparation of TCM of Ministry of Education, Jiangxi University of TCM, Nanchang, Jiangxi 330004, China;2.Preclinical Medicine College, Jiangxi University of TCM, Nanchang, Jiangxi 330004, China)

Objective: To research the effects of active components in exocarpium onthe proliferation of tracheal smooth muscle cells in guinea pig.Methods: Primary cell culture and the effects of active components Naringin, Meranzin and Meranzin hydrate in exocarpium on cell proliferation were determined by MTT method. Results: The results showed that Naringin had a remarkable promotive effect on the proliferation of tracheal smooth muscle cells (0.2~2.0 mg/mL,< 0.01). Meranzin hydrate could inhibit the proliferation of cells (0.1~1.0 mg/mL,< 0.01). Meranzin affected cells non-significantly (0.05~0.5 mg/mL,＞ 0.05). Conclusion:Naringin and Meranzin hydrate were the active components in exocarpium.

exocarpium; active components; tracheal smooth muscle cells in guinea pig; cell proliferation

1674-8085(2015)01-0088-04

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.018

2014-10-10；修改日期：2014-12-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81460575，81260612)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20132BAB205092）；江西中醫(yī)藥大學(xué)江西省研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(YC2014-S281)。

董 晶(1990-），女，山東德州人，碩士生，主要從事藥物分析專業(yè)(E-mail:dj900304@163.com);

肖移生(1976-)，男，江西峽江人，講師，碩士，主要從事中藥抗衰老研究(E-mail:190892207@qq.com);

陳海芳(1979-)，女，浙江寧波人，講師，博士，主要從事中藥分析研究(E-mail:chenhf88@126.com);

羅小泉(1966-)，男，江西都昌人，教授，碩士，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究(E-mail:lxqdjl@126.com);

黃佩蓓(1964-)，女，江西高安人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子生物學(xué)研究(E-mail：hppei@126.com);

裴 昆(1989-)，女，江西撫州人，碩士生，主要從事藥物分析研究(E-mail: 814696659@qq.com);

易徐航(1990-)，男，江西萍鄉(xiāng)人，碩士生，主要從事中藥分析研究(E-mail: 280829830@ qq.com);

*楊武亮(1965-)，男，江西南昌人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量控制及藥效學(xué)研究(E-mail:yangwuliang@163.com).