曲霉發(fā)酵啤酒糟培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

賓冬梅，李玉中，李小林

（衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院，湖南 衡陽 421008）

啤酒糟是生產啤酒的主要原料大米、麥芽等經糊化、糖化工藝進行過濾或壓濾之后殘留的固體物質，主要成分包括蛋白質、纖維組分、維生素、脂肪、礦物質及淀粉等[1]，含水量大，容易變質。通常，啤酒企業(yè)將啤酒糟直接作為粗飼料銷售，但因其纖維含量高、適口性差，養(yǎng)殖戶不能完全接收[2-5]；另有不少企業(yè)將其作為廢棄物排放，不僅浪費資源，還造成嚴重的環(huán)境污染。為了有效開發(fā)利用啤酒糟，試驗針對其粗纖維和粗蛋白高的營養(yǎng)特點，優(yōu)選出纖維素酶高產菌，將纖維素分解成可供利用的糖類，再經酵母菌和枯草芽孢桿菌進行二次混菌發(fā)酵，生產出高微生物蛋白啤酒糟飼料或微生態(tài)制劑，以達到立體開發(fā)啤酒糟的目的。

目前，國內外產纖維素酶的主要菌種是曲酶、木霉等[6-10]，世界上纖維素酶市場中的纖維素酶20%是來自木霉屬和曲霉屬[11]。筆者從富含纖維素的土壤中分離和篩選纖維素高效降解曲霉菌株，以啤酒糟為主料，添加不同的C 源和N 源，并調整其比例，觀察曲霉生長數目與形態(tài)，從而得出曲霉產纖維素酶活性最高的培養(yǎng)配方研究，以期篩選出發(fā)酵啤酒糟的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試啤酒糟及菌種 試驗所用的啤酒糟取自衡陽市燕京啤酒廠，經過干燥、過100 目篩、儲存?zhèn)溆谩Ｔ诤怅柺薪紖^(qū)及祁東縣采集富含纖維的稻田土壤樣本，從中提取活性菌種，在實驗室鑒定其為曲霉，作為供試菌種。

1.1.2 試驗儀器 試驗主要儀器有SW-SJ-1F 單人雙面潔凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、DHG-9040A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（寧波江南儀器廠）、FA2004N 電子天平（河南兄弟儀器設備有限公司）、WHY-2 水域恒溫振蕩器（江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠）、SPX-150BSH-Ⅲ 生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）活化培養(yǎng)基（馬丁氏培養(yǎng)基）：CMC-Na 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸銨1.5 g/L，瓊脂15 g/L ，pH 值6.0。（2）選擇培養(yǎng)基（以啤酒糟為主料加入C 源或N 源的培養(yǎng)基）：磷酸二氫鉀 0.5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，瓊脂14 g/L，明膠2 g/L，纖維素粉1.88 g/L（預先經1 mol/L 鹽酸冷處理12 h，以水清洗，無鹽酸后用來配置培養(yǎng)基），剛果紅0.2 g/L，pH 值6.0。（3）剛果紅纖維素瓊脂[12]：KH2PO40.5 g/L，MgSO40.25 g/L，瓊脂14 g/L，明膠2 g/L，纖維素粉1.88 g/L（纖維素粉預先經1 mol/L 鹽酸冷處理12 h，以水清洗，無鹽酸后用來配制培養(yǎng)基），剛果紅0.2 g/L，pH 值7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 曲霉的分離與鑒定 將采集的稻田土壤樣本用無菌水混合，充分振蕩，經滅菌紗布過濾，靜置，上清液接種于富集培養(yǎng)基中，取富集菌接種到PDA 培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)，進行菌株分離，將分離純化得到的菌株活化并配制成孢子懸浮液，分別點接到剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中，重復3 次，恒溫培養(yǎng)，用十字交叉法測量菌落直徑和透明圈直徑。根據菌落生長狀態(tài)、透明圈大小、透明圈清晰程度以及菌落和透明圈的比值，篩選菌株。用顯微鏡觀察菌絲及孢子梗形狀，并用油鏡觀察其孢子形態(tài)，參閱《中國真菌志》[13]等進行鑒定。結果顯示，篩選到的菌株為曲霉，命名曲霉6-3。

1.2.2 最適氮源和碳源的篩選 將曲霉6-3 接種于活化培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)7 d，取10 m L 無菌生理鹽水洗下孢子，加1 滴吐溫80 打散孢子團塊，用血球計數板計數，調整孢子濃度至105～106個/m L。稱取100.00 g 解凍的啤酒糟，分別取10.00 g 置于10個小燒杯中。在此基礎上，分別在小燒杯中添加0.40 g N源（分別為酵母浸液、硫酸銨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素）或碳源（分別為乳糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖），設置1個空白對照組（CK），對配置好的培養(yǎng)基編號，每個處理重復2 次。培養(yǎng)基滅菌后接種曲霉6-3，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d，觀察菌種長勢，篩選出促進曲霉6-3 生長的最適碳源和氮源。

1.2.3 氮源和碳源最佳添加量的確定 在篩選的最適碳源和氮源的基礎上，根據初步試驗結果[14]，設定最優(yōu)N 源的添加量分別為3%、4%、5%、6%，最優(yōu)C源的添加量分別為4%、6%、8%、10%。每個處理重復2 次，根據菌株長勢確定促進曲霉6-3 生長的最適碳源和氮源的添加量。

1.2.4 氮源和碳源混合的最佳配比 在確定最適碳源和氮源添加量的基礎上，依據氮碳源的比值3︰5、3︰6、3︰7、4︰5、4︰6、4︰7、5︰5、5︰6、5︰7，將加入的碳氮源與啤酒糟充分混勻。每個處理重復2次，根據菌株長勢確定促進曲霉6-3 生長氮碳源的最佳配比。

1.2.5 羧甲基纖維素鈉酶活力的測定 采取3,5-二硝基水楊酸（DNS）顯色法測定葡萄糖標準液的濃度，并繪制曲線，線性方程為y=0.441 4x+0.091 6，R2=0.993 4。啤酒糟發(fā)酵結束后，取各處理的啤酒糟加100 m L 蒸餾水，于40℃水浴振蕩浸提1 h，脫脂棉過濾，濾液于3 500 r/min 下離心5 min，上清液即粗酶液。在25 m L 具塞試管中加入1.5 m L 以pH 值5.0 檸檬酸緩沖液配制的1% CMC-Na 溶液，置于50 ℃ 水浴中預熱 5 min。加入0.5 mL 粗酶液酶，搖勻，50℃準確反應 40 min，之后加入DNS 試劑1.5 m L，放入沸水浴顯色 5 min，取出后立即置于冰水中冷卻至室溫，定容至 10 m L，搖勻。在波長540 nm 條件下測定其吸光值[14-15]。酶活單位的定義為在上述反應條件下，每分鐘催化纖維素水解生成 1 μg 葡萄糖的酶量為1個酶活力單位，用 U/m L 表示。

式中，S 為樣品平均吸光值在標準曲線上對應的葡萄糖含量（mg）；D 為定容體積；V 為參與反應的粗酶液體積（m L）；T 為反應時間（min）。

2 結果與分析

2.1 碳源的篩選

2.1.1 最適碳源 由圖1 可知，4種不同的碳源中最能促進曲霉6-3 生長的是乳糖，而蔗糖、淀粉、葡萄糖的促進效果差別不明顯。同時，對比只加氮源和只加碳源的處理，發(fā)現(xiàn)曲霉6-3 在只加入氮源的培養(yǎng)基中有利于菌絲生長，而在只加入碳源的培養(yǎng)基種則有利于孢子產生。

圖1 不同氮源對啤酒糟上曲霉6-3 生長的影響

2.1.2 碳源最佳添加量 試驗結果顯示，碳源添加量為6%的培養(yǎng)基中，曲霉6-3 長勢最好，其次是添加量為8%的培養(yǎng)基中，曲霉6-3 菌株長勢較好，而添加量為4%和10%的培養(yǎng)基中，曲霉6-3 菌株長勢一般。因此，可以認為碳源的最佳添加量范圍為5%～7%之間。

2.2 氮源的篩選

2.2.1 最適氮源 從圖2 中可以看出，5種氮源中最能促進曲霉6-3 生長的是胰蛋白胨，其次分別是牛肉膏、酵母粉和硫酸銨，促進曲霉6-3 生長效果最不明顯的是尿素。

圖2 不同碳源對啤酒糟上曲霉6-3 生長的影響

2.2.2 氮源最佳添加量 試驗結果顯示，氮源添加量為4%時，曲霉6-3 的長勢最好，其次是3%和5%的處理，二者的差異不明顯，而添加量為6%的培養(yǎng)基中，曲霉6-3菌株的長勢一般。因此，確定最適氮源——胰蛋白胨的最佳添加量為4%。

2.3 最適碳源和最適氮源的混合比例確定

圖3 不同氮碳源比例對曲霉6-3 生長的影響

由圖3 可知，隨著氮源添加量的增加，曲霉6-3的長勢越來越好，而碳源添加量的增加對曲霉的長勢影響不顯著；其中，碳氮比為4︰7、5︰5、5︰6的處理對曲霉6-3 的生長促進作用差異不明顯，而對曲霉6-3 生長促進作用最差的碳氮比是3︰5，而促進作用最明顯的碳氮比為5︰7。

2.4 發(fā)酵產物中的CMC 酶活力

從表1 中可以看出，碳氮比為 5︰7 的處理，發(fā)酵后啤酒糟的羧甲基纖維素酶活力最高，達188.49 IU，比空白對照處理的高121.2 IU，比其他碳氮比處理的高49.84～57.77 IU；各處理葡萄糖含量也以碳氮比為 5︰7 的處理最高，達0.38 g，是空白對照處理的2.71 倍，比其他碳氮比處理的高35.7%～46.2%。上述結果與從菌株長勢情況判斷得出的纖維素酶活性結論一致。同時，試驗結果也表明在啤酒糟中加入適當的外源物質有利于曲霉產生纖維素酶。

表1 不同碳氮比處理對曲霉6-3 纖維素酶活性的影響

3 結 論

綜上所述，試驗從富含纖維的土壤中提取到曲霉菌株曲霉6-3，初步篩選出其生長最適的碳源和氮源分別為乳糖和胰蛋白胨，其最佳添加量分別為6%和4%；促進曲霉6-3 生長的最優(yōu)碳氮比為5︰7，發(fā)酵后維素酶活力達188.49 IU，葡萄糖含量為0.38 g。這表明啤酒糟可以作為曲霉的優(yōu)良培養(yǎng)基，對選育優(yōu)良的啤酒糟纖維素分解菌具有一定的指導意義。

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