南極磷蝦油對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

周大勇，王君妍，劉瀟陽，林竹一，鄭　琳，陰法文，辛丘巖

（大連工業(yè)大學(xué)國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連　116034）

南極磷蝦油對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

周大勇，王君妍，劉瀟陽，林竹一，鄭琳，陰法文，辛丘巖

（大連工業(yè)大學(xué)國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116034）

為研究南極磷蝦油對小鼠免疫功能的影響，分別將高、中、低劑量（400、200、50mg／kg）全脂型蝦油組（WKO）和磷脂型蝦油組（PKO）每日灌胃1次。4周后測定小鼠免疫器官指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬能力及血漿IL－2、INF－γ水平。與空白組相比，高劑量PKO組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高；低、高劑量WKO組小鼠脾臟指數(shù)顯著升高；中、高低劑量WKO組和低、中劑量PKO組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力顯著提高；低、高劑量WKO組和中劑量PKO組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著提高；3個劑量WKO組和低劑量PKO組小鼠血漿IL－2水平顯著升高；低、高劑量WKO組和中劑量PKO組小鼠INF－γ水平顯著升高。

南極磷蝦油；小鼠；免疫調(diào)節(jié)；細(xì)胞因子

0　引　言

南極磷蝦（Euphausiasuperba）是地球上數(shù)量最大的單種生物資源之一。最近的研究數(shù)據(jù)顯示，南極磷蝦的總生物量為3.79億噸，年成蝦產(chǎn)量為3.42～5.36億噸［1］。南極磷蝦油脂約占干基重量的10%～20%，主要由甘油酯、磷脂、游離脂肪酸、甾醇及蝦青素組成［2］，具有抑制肝脂肪化、抗過敏、降血脂、降血糖等作用［3－4］。

研究表明，魚油能夠增強小鼠的單核巨噬細(xì)胞吞噬功能［5］。相比之下，甘油三酯型魚油在改善模型小鼠的血清溶血素水平及抗體生成細(xì)胞數(shù)，提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，促進腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力方面優(yōu)于乙酯型魚油［6］。雖然近年來南極磷蝦油的活性研究較多，但其免疫調(diào)節(jié)作用尚未見報道。本實驗研究了南極磷蝦油對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，為南極磷蝦油的深入開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1實驗材料

南極磷蝦粉，遼寧省大連市海洋漁業(yè)集團公司，－20℃儲藏備用；健康雄性昆明種小鼠（20± 2）g，大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

CCK－8試劑盒，東仁化學(xué)科技有限公司；細(xì)胞因子（IL－2、TNF－γ）免疫測定試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RPMI－1640培養(yǎng)基、Hank’s平衡鹽溶液，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚，美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；臺盼藍(lán)，中科邁晨科技有限公司；其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1磷蝦油的提取

分別采用正己烷及無水乙醇浸提全脂型南極磷蝦油（WKO）及磷脂型南極磷蝦油（PKO），浸提方法參照本課題組的前期研究［7］。

1.2.2實驗動物分組和處理

昆明種小鼠于（25±2）℃下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠分為8組，每組6只。第1組為空白對照組，灌胃生理鹽水；第2組為陽性對照組，灌胃香菇多糖（10mg／kg），3～5組分別為全脂型蝦油低劑量組（L－WKO）、中劑量組（M－WKO）、高劑量組（H－WKO），分別按體重灌胃50、200、400mg／kg；6～8組分別為磷脂型蝦油低劑量組（L－PKO）、中劑量組（M－PKO）、高劑量組（HPKO），分別按體重灌胃50、200、400mg／kg。每日灌胃1次，持續(xù)4周（蝦油溶解于醫(yī)藥級PEG400中）。實驗期間動物可自由進食、飲水。4周后，將小鼠禁食12h，期間正常飲水，然后采集血液、脾臟、胸腺、腹腔細(xì)胞等標(biāo)本用于后續(xù)實驗。

1.2.3小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

實驗動物頸椎脫臼致死后，稱取體重；小鼠解剖后，取脾臟及胸腺，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量。根據(jù)公式（1）和（2）計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

式（1）、（2）中：m1為小鼠脾臟質(zhì)量，g；m2為小鼠胸腺質(zhì)量，g；m為小鼠體重，g。

1.2.4小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性的測定

1.2.4.1淋巴細(xì)胞的制備將處死后的小鼠放入75%乙醇中浸泡5min消毒，在無菌條件下，剪開皮膚和腹壁，剝離脾臟并稱重，在200目尼龍網(wǎng)上用塑料注射器芯研碎脾臟獲取單細(xì)胞懸液，用0.83%氯化銨破碎紅細(xì)胞，用Hank’s液洗3次，1000r／min離心15min棄上清，加入完全培養(yǎng)基。用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性，保證活細(xì)胞數(shù)＞95%，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106個／mL［8］。

1.2.4.2南極磷蝦油對淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

采用CCK－8比色法測定南極磷蝦油對淋巴細(xì)胞增殖活性的影響。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔添加200μL相應(yīng)實驗組脾細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為5×106個／mL，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)結(jié)束前4h，向每孔中加入10μL的CCK－8。繼續(xù)孵育4h。用多孔酶標(biāo)測定儀于450nm處測定吸光度，測定及計算方法參照試劑盒說明書。

1.2.5小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定

腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能根據(jù)LIU等［9］的方法檢測。

在無菌條件下，用注射器向小鼠腹腔注入8mLHank’s平衡鹽緩沖液，收集腹腔液，離心，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個／mL，在無菌96孔板中分別每孔加入200μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，棄上清，去除非貼壁細(xì)胞，每孔加入100μL完全培養(yǎng)基，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)2h，每孔中加入100μL濾過的1%中性紅生理鹽水溶液，0.5h后棄上清，Hank’s平衡鹽緩沖液洗3次。每孔加入200μL細(xì)胞裂解液，10min后于450nm處測定吸光值。巨噬細(xì)胞吞噬能力按公式（3）計算。

1.2.6細(xì)胞因子（IL－2、TNF－γ）的檢測

小鼠血漿細(xì)胞因子水平檢測根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒上的說明進行操作。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示（n＝6）。采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對組間數(shù)據(jù)差異性進行單因素方差分析（One－AVOVA）、LSD法檢驗。

2　結(jié)果與討論

2.1南極磷蝦油對小鼠胸腺及脾臟指數(shù)的影響

圖1為南極磷蝦油對小鼠胸腺指數(shù)的影響情況，與空白對照組小鼠相比，陽性對照組及LWKO組、M－WKO組、L－PKO組和H－PKO組小鼠的胸腺指數(shù)均有增加，其中H－PKO組與空白組相比顯著增加（＊P＜0.05）。

圖1　南極磷蝦油對小鼠胸腺指數(shù)的影響Fig.1　Effect　of　consumption　of　krill　oils　on　thymus index　of　mice

圖2　南極磷蝦油對小鼠脾臟指數(shù)的影響Fig.2　Effect　of　consumption　of　krill　oils　on　spleen index　of　mice

免疫器官指數(shù)可反映機體免疫活性細(xì)胞的發(fā)育、增殖及功能狀態(tài)。免疫保護劑或增強劑能增加機體脾臟和胸腺指數(shù)［10］。據(jù)報道，富含不飽和脂肪酸的堿蓬籽油具有增加免疫低下小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的作用［11］。

2.2南極磷蝦油對小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖3為南極磷蝦油對小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響情況，與空白對照組小鼠相比，陽性對照組和所有蝦油組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力均有所增加，其中陽性對照組、M－WKO組、L－PKO組及M－PKO組顯著增加（＊P＜0.05），H－WKO組極顯著增加（＊＊P＜0.01）。

圖3　南極磷蝦油對小鼠淋巴細(xì)胞增值的影響Fig.3　Effect　of　consumption　of　krill　oils　on　the lymphocyte　proliferation　of　mice

淋巴細(xì)胞的增殖和分化是免疫應(yīng)答的一個重要階段，能夠直接反應(yīng)免疫應(yīng)答的能力。研究表明，高含量EPA／DHA甘油三酯型魚油可顯著提高免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力［6］。

2.3南極磷蝦油對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

圖4為南極磷蝦油對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響情況，與空白對照組小鼠相比，陽性對照組和所有蝦油組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力均有增加，其中L－WKO組、H－WKO組與空白組相比顯著增加（＊P＜0.05），M－PKO組極顯著增加（＊＊P＜0.01）。

圖4　南極磷蝦油對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Fig.4　Effect　of　consumption　of　krill　oils　on　phagocytic function　of　macrophage　of　mice

吞噬細(xì)胞是機體非特異性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分之一，同時在特異性免疫應(yīng)答的各個階段也起重要作用。據(jù)報道，魚油可顯著改善免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，且高含量EPA／DHA甘油三酯型魚油效果最優(yōu)［6］。

2.4南極磷蝦油對小鼠細(xì)胞因子的影響

2.4.1對小鼠血漿IL－2水平的影響

圖5為南極磷蝦油對小鼠細(xì)胞因子IL－2水平的影響情況，與空白對照組相比，L－PKO組小鼠血漿IL－2水平顯著上升（＊P＜0.05），陽性對照組和3個劑量WKO組極顯著上升（＊＊P＜0.01）。

圖5　南極磷蝦油對小鼠體內(nèi)IL－2水平的影響Fig.5　Effect　of　consumption　of　krill　oils　on　plasma　IL－2 level　of　mice

2.4.2對小鼠血漿IFN－γ水平的影響

圖6為南極磷蝦油對小鼠細(xì)胞因子IFN－γ水平的影響情況，與空白對照組相比，L－WKO組、H－WKO組和M－PKO組小鼠血漿IFN－γ水平極顯著上升（＊＊P＜0.01）。

圖6　南極磷蝦油對小鼠體內(nèi)IFN－γ水平的影響Fig.6　Effect　of　consumption　of　krill　oils　on　plasma IFN－γlevel　of　mice

IL－2和IFN－γ作為反映機體細(xì)胞免疫功能的重要細(xì)胞因子，其水平上升說明南極磷蝦油具有上調(diào)細(xì)胞免疫功能的能力。研究表明，高含量EPA／DHA甘油三酯型魚油可提高免疫低下小鼠的細(xì)胞免疫功能［6］。

3　結(jié)　論

綜上所述，南極磷蝦油可提高小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，促進小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，并上調(diào)小鼠血漿IL－2和 IFN－γ水平，對小鼠免疫功能具有上調(diào)作用。

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ImmunomodulatoryeffectsofAntarctic krill（Euphausiasuperba）oilonmouse

ZHOUDayong，WANGJunyan，LIUXiaoyang，LINZhuyi，ZHENGLin，YINFawen，XINQiuyan
（NationalEngineeringResearchCenterofSeafood，DalianPolytechnicUniversity，Dalian116034，China）

Inthisstudy，immunomodulatoryeffectsofAntarctickrill（Euphausiasuperba）oilon mousewerestudied.Low，middleandhigh－doseofwholekrilloil（WKO）andphospholipidstype krilloil（PKO）weregivenbygavageonceaday，respectively.Fourweekslater，theimmuneorgan index，thereproductivecapacityofspleenlymphocytes，thephagocyticfunctionofmacrophageand theplasmalevelsofIL－2andINF－γweretested.Resultsindicatedthatthethymusindexofmicein high－dosePKOgroupwasincreasedsignificantlybycomparedwiththeblankcontrolgroup；the spleenindexofmiceinlowandhigh－doseWKOgroupswereincreasedsignificantly；thereproductive capacityofspleenlymphocytesofmiceinmiddleandhigh－doseWKOgroupsaswellaslowand middle－dosePKOgroupswereenhancedsignificantly；thephagocyticfunctionofmacrophageofmice inlowandhigh－doseWKOgroupsaswellasmiddle－doseofPKOgroupsstrengthenedsignificantly；plasmalevelofIL－2ofmiceinthethree－doseWKOgroupsaswellaslow－dosePKOgroupswere elevatedsignificantly；plasmalevelofINF－γofmiceinlowandhigh－doseWKOgroupsand middle－dosePKOgroupwereelevatedsignificantly.

Antarctickrilloil；mouse；immunomodulation；cytokines

TS254.5

A

1674－1404（2015）02－0097－04

2015－01－09.

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA090801）；遼寧省高等學(xué)校重大科技平臺項目（2011191）.

周大勇（1977－），男，教授；通信作者：辛丘巖（1959－），男，高級工程師.