基于線粒體Cytb基因全序列的東流水牛群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

趙拴平,賈玉堂,徐　磊,阮永明

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031)

基于線粒體Cytb基因全序列的東流水牛群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

趙拴平,賈玉堂*,徐磊,阮永明

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031)

[目的]分析安徽東流水牛群體遺傳結(jié)構(gòu)，為今后開展地方水牛品種研究提供依據(jù)。[方法]利用測序技術(shù)對31頭東流水牛細(xì)胞色素b 基因(Cytb)進(jìn)行序列測定和分析，[結(jié)果]發(fā)現(xiàn)Cytb基因全長1 140bp，共檢測到17個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，構(gòu)成9種單倍型，單倍型多樣度為(0.544±0.107)，核苷酸多樣度為(0.00112±0.00091)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)東流水牛Cytb基因具有兩種終止密碼子AGA和AGG。[結(jié)論]東流水牛遺傳多樣性豐富，且起源于2個(gè)母系。

水牛；Cytb；遺傳多樣性

東流水牛主要分布于安徽省沿江丘陵湖區(qū)的東至縣、望江縣、宿松縣和貴池區(qū)等地。中心產(chǎn)區(qū)東至縣位于長江中下游南岸，屬于濱湖地區(qū)。東流水牛體型高大，體格魁偉，軀干結(jié)實(shí)，肌肉發(fā)達(dá)，肉質(zhì)細(xì)嫩，是安徽省優(yōu)良地方水牛品種，也是中國優(yōu)良的水牛群體之一[1]。近年來隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，農(nóng)村勞動(dòng)力的轉(zhuǎn)移，以及飼養(yǎng)水牛比較效益的下降，加之“以機(jī)代牛”，東流水牛的飼養(yǎng)量越來越少[2]，東至縣2002年以前東流水牛飼養(yǎng)量達(dá)到3.8萬頭，年出欄量達(dá)10 000頭以上，到目前為止東流水牛存欄僅6 000余頭，其中純種東流水牛母牛存欄不足1 000頭[2]，亟需高度重視。

線粒體DNA細(xì)胞色素b(Cytb)基因是唯一一個(gè)由mtDNA編碼的細(xì)胞色素，在線粒體基因組中進(jìn)化速度適中，包含從種內(nèi)到種間的進(jìn)化遺傳信息，且在一定的進(jìn)化尺度內(nèi)不受飽和效應(yīng)的嚴(yán)重影響，被廣泛用于家畜起源進(jìn)化、親緣關(guān)系和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究[3,4]。目前關(guān)于東流水牛mtDNA Cytb基因遺傳多樣性的研究尚未見報(bào)道。本研究通過對Cytb基因序列進(jìn)行測序分析研究，探討東流水牛的遺傳多樣性，以期為東流水牛品種資源保護(hù)和開發(fā)利用提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

在安徽省池州市東至縣采集31頭純種東流水牛血液10 mL，ACD抗凝，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，凍存于-80℃冰箱中備用。利用商業(yè)化DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2Cytb基因擴(kuò)增和測序

利用引物(Cytb-F1：ACCACGACCAATGATATGAAAAACC和Cytb-R1：GAGGTTGGTTGTTCTCCTTTTCTGG)[5]擴(kuò)增獲得水牛Cytb基因序列，擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min→32個(gè)循環(huán)(95℃ 30 s→58℃30s→72℃1min)→72℃ 5min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,用凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化與回收,由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對，利用MEGA 5.10[6]查找序列的多態(tài)位點(diǎn)，利用DnaSP 5.1軟件[7]統(tǒng)計(jì)核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)和單倍型多樣性(Haplotype diversity)等多態(tài)性指標(biāo)。利用MEGA 5.10軟件構(gòu)建N-J(Neighbor-joining)系統(tǒng)發(fā)生樹，分析不同單倍型間的進(jìn)化關(guān)系，遺傳距離計(jì)算采用Maximum Composite Likelihood模型，Bootstrap抽樣1 000次。

2　結(jié)果與分析

2.1東流水牛Cytb基因的堿基組成

31頭東流水牛線粒體Cytb基因全序列長為1 140 bp，無插入和缺失，其序列的平均堿基組成見表1，堿基A、T、G、C的平均含量分別為31.1%、25.0%、13.9%、30.0%，4 種堿基含量差異較大，其中A+T 含量(56.1%)高于G+C 含量(43.9%)。密碼子不同位點(diǎn)的堿基組成也存在差異，密碼子第1位富含堿基A(29.7%)，第2位富含堿基T(41.0%)，第3位富含堿基A(43.1%)，密碼子第1位各堿基組成比例差異不大；但密碼子第2位中T 堿基的頻率高達(dá)41.0%，G堿基僅為13.9%；密碼子第3位中A堿基頻率高達(dá)43.1%，而G堿基僅占6.1%，說明東流水牛Cytb基因密碼子第2和第3位都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的堿基偏倚性。

表1　東流水牛Cytb基因全序列的平均堿基組成

2.2東流水牛Cytb基因全序列的核苷酸變異

東流水牛Cytb基因全序列核苷酸變異和多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，31個(gè)水牛個(gè)體Cytb基因全序列共檢測到17個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，約占核苷酸總數(shù)的1.49%，構(gòu)成9個(gè)單倍型，其核苷酸多度樣度為(0.00112±0.00091)，單倍型多樣度為(0.544±0.107)。17個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中有15個(gè)為轉(zhuǎn)換，2個(gè)顛換，導(dǎo)致了7個(gè)氨基酸的錯(cuò)義突變(圖2)，位點(diǎn)分別是6(賴氨酸K→谷氨酸E)、17(丙氨酸A→蘇氨酸T)、171(天冬氨酸D→酪氨酸Y)、199(苯丙氨酸F→酪氨酸Y)、238(丙氨酸A→蘇氨酸T)、358(酪氨酸Y→組氨酸H)、372(異亮氨酸I→纈氨酸V)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)東流水牛Cytb 基因有兩種終止密碼子AGA 和AGG。

圖1　東流水牛9種單倍型的多態(tài)位點(diǎn)　　　　　　圖2　東流水牛Cytb基因7個(gè)氨基酸錯(cuò)義突變位點(diǎn)

2.3東流水牛NJ系統(tǒng)發(fā)育分析

以江河型摩拉水牛序列(EF409940)做外群，構(gòu)建東流水牛31個(gè)個(gè)體、9種單倍型的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。圖中可以看出，東流水牛9種單倍型聚為兩大類，即支系A(chǔ)和支系B，支系A(chǔ)中有8個(gè)單倍型，代表30個(gè)個(gè)體，支系B中只有1個(gè)單倍型，代表1個(gè)個(gè)體。

圖3　東流水牛9種單倍型的N-J系統(tǒng)發(fā)生樹

3　討論

謝文美等[8]利用測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)研究了中國21個(gè)水牛群體的遺傳變異，發(fā)現(xiàn)東流水牛遺傳多樣性較為豐富，且具有2 個(gè)母系起源。齊國強(qiáng)等[9]通過對我國10個(gè)地方水牛品種遺傳多樣性分析，同樣發(fā)現(xiàn)東流水牛具有較為豐富的遺傳多樣性。本研究通過對31頭安徽東流水牛mtDNA Cytb基因完整序列的測定，發(fā)現(xiàn)其17個(gè)多態(tài)位點(diǎn)導(dǎo)致7個(gè)氨基酸的錯(cuò)義突變，表明東流水牛具有豐富的遺傳多樣性。系統(tǒng)發(fā)育研究分析發(fā)現(xiàn)，東流水牛9種單倍型聚為A、B兩個(gè)支系，支系A(chǔ) 是主要支系，支系B只有1個(gè)個(gè)體，這樣的分布模式很可能是由于樣本數(shù)量少引起的。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)東流水牛Cytb基因有兩種終止密碼子AGA 和AGG，這與李世平等[10]在海子水牛和張春梅等[11]在德宏水牛中的研究相一致，表明中國水?？赡芫哂袃煞N終止密碼子AGA 和AGG。

我國家養(yǎng)水牛屬于沼澤型水牛，由于其毛色、角形等特征與印度野水牛極為相似，不少中外學(xué)者認(rèn)為中國水牛起源于印度野水牛[1]，但我國考古工作者在全國多處發(fā)現(xiàn)有家養(yǎng)水牛馴化的痕跡，說明我國的家養(yǎng)水牛是由我國的先民自己馴化而成[1]，但Kierstein等[12]通過對80頭水牛進(jìn)行遺傳多樣性分析,提出沼澤型水牛和江河型水牛可能來自于印度次大陸的同一個(gè)馴化事件。Lei等[13]對中國7個(gè)水牛群體和東南亞水牛進(jìn)行分析研究，提出沼澤型水牛可能是在中國單獨(dú)馴化而成。Yue等[14]通過對中國22個(gè)地方水牛品種進(jìn)行分析，證明本地水牛是在中國西南地區(qū)馴化而成。Kumar等[15-16]通過系統(tǒng)研究印度江河型水牛的遺傳多樣性，推測江河型水?？赡苁窃谟《任鞑狂Z化的。Mishra等[17]通過分析印度東北部、中國、地中海和東南亞水牛mtDNA，證明部分水牛在印度東北部地區(qū)馴化形成，而后傳播到東南亞。總之，要徹底弄清中國水牛的起源進(jìn)化關(guān)系，尚需進(jìn)一步深入研究。

4　小結(jié)

本試驗(yàn)研究了我國安徽東流水牛線粒體Cytb基因的遺傳多態(tài)性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，證明東流水牛線粒體遺傳多樣性豐富，且具有2個(gè)母系起源，為今后開展我國地方水牛品種遺傳資源保護(hù)和開發(fā)利用提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。

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Population genetic structure analysis of Dongliu Buffalo by Mitochondrial Cytb Gene Full Length Sequence

ZHANG Shuan-ping,JIA Yutang,XU Lei,RUAN Yong-ming

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryResearch,AnhuiAcademyofAgriculturalSciences,Hefei, 230031,China)

【Objective】 The aim of this study was to investigate genetic characteristics of Anhui Dongliu Buffalo, and provide scientific basis for further study of local Buffalo.【Methods】 The full length of mtDNA Cytb gene were sequenced and analyzed from 31 Dongliu buffalo. 【Results】The results showed that the length of the complete mtDNA Cytb sequence was 1140 bp, and 17 polymorphisms and 9 haplotypes were detected. The diversity of nucleotide and haplotype were (0.00112±0.00091) and (0.544±0.107), respectively. Two stop codons, AGA and AGG, were detected in Cytb gene in Dongliu buffaloes. 【Conclusions】The mitochondrial genetic diversity of Dongliu buffalo population was rich, and originated from two matrilines.

buffalo; Cytb; genetic diversity

2015-04-21修改日期:2015-04-30

國家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-合肥綜合試驗(yàn)站(CARS-38)，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目(14B0428)。

趙拴平(1984-)，女，山西長治人，博士，助理研究員，主要從事肉牛分子育種工作。E-mail:zhaoshuanping@163.com。

賈玉堂(1962-)，男，副研究員，主要從事草食動(dòng)物遺傳育種工作。E-mail:yutang2018@163.com 。

S823.2

A

1001-9111(2015)05-0015-04