丹蛭降糖膠囊干預(yù)2型糖尿病血管并發(fā)癥的實驗研究

沈安魯，王　靚，彭代銀，孔德佳

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230038）

實驗研究

丹蛭降糖膠囊干預(yù)2型糖尿病血管并發(fā)癥的實驗研究

沈安魯，王靚，彭代銀，孔德佳

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230038）

［目的］探討丹蛭降糖膠囊干預(yù)2型糖尿病大鼠血管并發(fā)癥的機制。［方法］采用高糖高脂飼料聯(lián)合STZ注射制備2型糖尿病大鼠模型，觀察丹蛭降糖膠囊干預(yù)8周后模型大鼠主動脈形態(tài)學(xué)改變、主動脈組織AGEs、RAGE和血清VCAM-1、ICAM-1含量的變化。［結(jié)果］高糖高脂飼料聯(lián)合STZ注射后模型大鼠腹主動脈出現(xiàn)顯著病理學(xué)改變，腹主動脈AGEs、RAGE含量顯著升高（P＜0.01），血清VCAM-1、ICAM-1含量顯著升高（P＜0.01）；而丹蛭降糖膠囊各劑量組大鼠的腹主動脈病理學(xué)改變得到不同程度改善，腹主動脈AGEs、RAGE含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），血清VCAM-1、ICAM-1含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。［結(jié)論］丹蛭降糖膠囊能夠有效防治2型糖尿病模型大鼠主動脈病理損傷，其干預(yù)機制與調(diào)節(jié)AGEs-RAGE通路密切相關(guān)。

丹蛭降糖膠囊；AGEs-RAGE系統(tǒng)；2型糖尿??；血管并發(fā)癥；實驗研究

隨著科學(xué)技術(shù)的進步和人民生活水平的提高，人們生活飲食習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)隨之改變，無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，糖尿病已經(jīng)成為全球關(guān)注的嚴重公共衛(wèi)生問題。糖尿病以持續(xù)性的高血糖為特點，長期存在的高血糖會導(dǎo)致各種組織，尤其是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。血管并發(fā)癥是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥，更是影響糖尿病患者生存的重要因素，已成為我國糖尿病致殘率和致死率最高、危害最大的慢性并發(fā)癥。糖尿病尤其是2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）引起血管并發(fā)癥的問題一直備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本課題組的前期臨床及實驗研究均表明，益氣養(yǎng)陰活血法之中藥復(fù)方丹蛭降糖膠囊可有效防治T2DM血管并發(fā)癥［1-2］，在此基礎(chǔ)上，本實驗進一步深入探討其作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　實驗材料

1.1藥品與試劑丹蛭降糖膠囊（由太子參、牡丹皮、熟地黃、澤瀉、菟絲子、水蛭組成）為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑（皖藥制字Z20090006），批號:20111102。鹽酸吡格列酮由杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格:每片15 mg；批號:111001。晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、細胞間粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細胞間粘附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的ELISA試劑盒均由上海森雄實業(yè)科技有限公司提供。STZ為美國Sigma公司產(chǎn)品，批號:20120121544。

1.2動物清潔級SD大鼠，雄性，180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK皖2011-002。

1.3儀器Multiskan MK2型酶標儀:由Labsystem生產(chǎn)；Wellwash 4 MK2型洗板機:由Labsystem生產(chǎn)；TGL-16GB型離心機:由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；GL-88B型漩渦混合器:由其林貝爾儀器制造公司生產(chǎn)；精確電子天平:由日本AND公司生產(chǎn)。

2　方法與結(jié)果

2.1造模、分組及給藥SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，從中隨機抽取10只作為正常對照組，其余大鼠進行造模。造模大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料（在10 kg基礎(chǔ)飼料中加入150 g食鹽、50 g白糖、2 kg豬油、400 g麻油、2 kg花生、900 g雞蛋，碳水化合物48%，脂肪22%，蛋白質(zhì)22%）［3］，高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后大鼠禁食12 h，腹腔注射STZ 30 ml/kg進行造模。1周后眼眶取血，使用羅氏血糖儀測定血糖值，隨機血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠造模成功［4-6］。正常對照組喂養(yǎng)普通大鼠飼料，僅注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。從造模成功的糖尿病大鼠中隨機分為5組:模型組、鹽酸吡格列酮組、丹蛭降糖膠囊高劑量組、丹蛭降糖膠囊中劑量組、丹蛭降糖膠囊低劑量組，每組10只。給藥劑量分別為:正常對照組和模型組均給予生理鹽水5 ml/（kg·d）灌胃；鹽酸吡格列酮組按5.3 mg/（kg·d）予鹽酸吡格列酮（相當于60 kg成人劑量的7倍）水溶液灌胃［7］；丹蛭降糖膠囊治療組予高、中、低劑量丹蛭降糖膠囊水溶液灌胃［高劑量組劑量為13 g生藥/ （kg·d）、中劑量組劑量為6.5 g生藥 /（kg·d）、低劑量組劑量為3.2 g生藥 /（kg·d），分別相當于60 kg成人劑量的14、7、3.5倍］［8］，連續(xù)給藥8周。每籠5只大鼠，墊料每天換1次。正常對照組予以普通飼料，其余組均予以高糖高脂飼料。給藥8周后大鼠取血及腹主動脈按AGEs，RAGE，VCAM-1和ICAM-1的ELISA試劑盒要求進行相關(guān)指標檢測。

2.2丹蛭降糖膠囊干預(yù)后大鼠腹主動脈的形態(tài)學(xué)改變模型組大鼠腹主動脈血管內(nèi)壁肉眼可見粗糙不平，有少量黃色斑塊，鏡下可見內(nèi)膜損傷，可見泡沫細胞，并有一定程度平滑肌內(nèi)移，說明采用高糖高脂飼料復(fù)合STZ法復(fù)制的T2DM模型大鼠腹主動脈發(fā)生了病理變化。而丹蛭降糖膠囊各劑量組及鹽酸吡格列酮組大鼠經(jīng)藥物干預(yù)8周后，各組大鼠腹主動脈病理改變均有不同程度改善。見圖1。

2.3丹蛭降糖膠囊對大鼠腹主動脈組織AGEs、RAGE的影響見表1。

由表1可見，造模后T2DM模型大鼠腹主動脈AGEs、RAGE含量明顯升高，與正常對照組大鼠比較有顯著性差異（P＜0.01），說明模型大鼠腹主動脈AGEs-RAGE系統(tǒng)被顯著激活；丹蛭降糖膠囊各劑量組及鹽酸吡格列酮組大鼠經(jīng)藥物干預(yù)8周后，各組主動脈AGEs、RAGE含量明顯降低，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），說明丹蛭降糖膠囊及鹽酸吡格列酮能夠顯著抑制T2DM模型大鼠腹主動脈AGEs-RAGE系統(tǒng)的激活。

2.4丹蛭降糖膠囊對血清VCAM-1和ICAM-1的影響 見表2。

由表2可見，造模后T2DM模型大鼠血清VCAM-1和ICAM-1含量明顯升高，與正常對照組大鼠比較有顯著性差異（P＜0.01），說明模型大鼠VCAM-1和ICAM-1被顯著激活；丹蛭降糖膠囊各劑量組及鹽酸吡格列酮組大鼠經(jīng)藥物干預(yù)8周后，各組大鼠血清VCAM-1和ICAM-1含量明顯降低，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），說明丹蛭降糖膠囊及鹽酸吡格列酮能顯著降低T2DM模型大鼠血清VCAM-1 和ICAM-1含量。

表1　各組對大鼠腹主動脈AGEs和RAGE含量的影響?。ā纒）

表1　各組對大鼠腹主動脈AGEs和RAGE含量的影響　（±s）

注:與正常對照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01；下同

組別　n　劑量（g/kg）　AGEs（ng/L）　RAGE（ng/L）正常對照組　10　-　152.149±15.326　157.537±17.225模型組　10　-　233.207±28.654①　223.451±24.086①鹽酸吡格列酮組　10　0.0053　157.767±16.606③　167.063±15.048③丹蛭降糖膠囊低劑量組　10　3.2　188.775±25.639③　199.649±20.234②丹蛭降糖膠囊中劑量組　10　6.5　162.883±12.730③　187.992±22.278③丹蛭降糖膠囊高劑量組　10　13.0　150.115±18.136③　180.085±14.409③

圖1　各組大鼠腹主動脈組織形態(tài)學(xué)變化

3　討論

近年來世界各國T2DM的患病率均有急劇上升的趨勢，WHO預(yù)測2025年T2DM患者將突破3億，T2DM是糖尿病人群的主體，占90%左右［9］。糖尿病為全身代謝性疾病，需要終身治療，而血管病變由于機制復(fù)雜，一種藥物往往很難控制病情的發(fā)生發(fā)展，中醫(yī)藥注重整體調(diào)節(jié)和多重治療作用，具有多渠道、多途徑、多靶點、價廉有效等優(yōu)勢，且可長期應(yīng)用及預(yù)防并發(fā)癥的出現(xiàn)，在糖尿病尤其是血管病變的防治方面顯示出了良好的臨床應(yīng)用前景。

表2　對大鼠血清VCAM-1和ICAM-1含量的影響　（±s）

表2　對大鼠血清VCAM-1和ICAM-1含量的影響?。ā纒）

組別　n　劑量（g/kg）　VCAM-1（ng/L）　ICAM-1（ng/L）正常對照組　10　-　4.542±0.635　2.848±0.446模型組　10　-　7.358±0.954①　6.651±0.958①鹽酸吡格列酮組　10　0.0053　5.665±0.769③　3.453±0.584③丹蛭降糖膠囊低劑量組　10　3.2　6.348±0.834②　4.957±0.887③丹蛭降糖膠囊中劑量組　10　6.5　5.928±0.808③　4.092±0.436③丹蛭降糖膠囊高劑量組　10　13.0　5.042±0.728③　3.415±0.675③

從中醫(yī)學(xué)理論來說，氣陰虧虛是糖尿病及其血管病變的病理基礎(chǔ)，絡(luò)阻血瘀是糖尿病及其血管病變的基本病理變化，并貫穿于糖尿病及其血管病變的全過程，氣陰兩虛、絡(luò)阻血瘀是糖尿病血管病變的主要證型，益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)法是治療糖尿病血管病變的主要方法［10-11］。丹蛭降糖膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科的經(jīng)驗方，具有益氣養(yǎng)陰活血之功效，臨床主要應(yīng)用于治療T2DM合并血管病變，臨床運用多年，療效顯著。

糖尿病血管病變的產(chǎn)生與發(fā)展與AGEs關(guān)系密切，高血糖促進糖基化終末產(chǎn)物的生成，使蛋白形成交聯(lián)大分子，損傷血管內(nèi)皮細胞，促使內(nèi)皮細胞凋亡，從而主動脈順應(yīng)性降低［12］。AGEs與受體結(jié)合，誘導(dǎo)核因子-κB（nudear factorkappaB，NF-κB）表達增加，能增加ICAM-1、VCAM-1等的表達，并激活腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β1）等多種細胞因子，參與血管病變的發(fā)生［13］。

本實驗結(jié)果顯示:丹蛭降糖膠囊能夠有效防治T2DM模型大鼠的腹主動脈血管損傷，同時能夠顯著降低模型大鼠腹主動脈AGEs、RAGE含量（P＜0.05或P＜0.01），減少血清VCAM-1和ICAM-1含量（P＜0.05或P＜0.01），說明丹蛭降糖膠囊能夠有效防治T2DM并發(fā)血管損傷，且其調(diào)控機制與抑制AGEs-RAGE系統(tǒng)的激活相關(guān)，但其具體調(diào)控靶點尚未完全闡明。因此，課題組下一步將借助血清藥理學(xué)實驗技術(shù)，通過丹蛭降糖膠囊含藥血清的體外干預(yù)，揭示丹蛭降糖膠囊調(diào)控AGEs-RAGE通路的具體機制，為中藥干預(yù)糖尿病血管合并癥的臨床合理化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

［1］方朝暉，倪英群，鮑陶陶，等.益氣養(yǎng)陰活血法對2型糖尿病患者血管內(nèi)皮黏附狀態(tài)及炎癥損傷影響的臨床研究［J］.中國中醫(yī)急癥，2008，17（11）:1532-1534.

［2］吳吉萍，方朝暉，倪英群.益氣養(yǎng)陰活血中藥對2型糖尿病合并血管病變的干預(yù)研究［J］.安徽醫(yī)藥，2014，18（4）: 735-736.

［3］王聿杰，張世光，鄭曉偉.慢性氯化鈷處理對GK糖尿病大鼠缺氧誘導(dǎo)因子的表達及心梗面積的影響［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2008，35（6）:712-718.

［4］徐志偉.2型糖尿病下肢血管病變相關(guān)危險因素分析［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2012，33（3）:499-500.

［5］金智生，李甜，陳雪.金匱腎氣丸對2型糖尿病腎病大鼠IGF-1及ET的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2011，45（11）: 76-79.

［6］薛紅麗，張曾，王文健，等.益氣增敏方對2型糖尿病大鼠尿微量白蛋白及胰島素抵抗的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2011，11（33）:4123-4125.

［7］羅麗華，侯艷麗，盧清君，等.降糖明目湯對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜促血管生成因子的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，32（1）:47-49.

［8］王巍，于世家，謝映紅.糖末寧顆粒對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)血管內(nèi)皮生長因子表達的影響［J］.中華保健醫(yī)學(xué)雜志，2012，14（1）:19-21.

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［10］謝毅強，王華，吳月平，等.2型糖尿病大血管病變患者胰島素抵抗與中醫(yī)證候的相關(guān)性研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（10）:2610-2611.

［11］廖冬燕，屈澤強，鐘振國，等.三七總皂苷對糖尿病小鼠空間認知功能改善及海馬神經(jīng)的保護作用研究［J］.廣西中醫(yī)藥，2014，37（6）:66-70.

［12］Vasdev S，Gill V，Singal P.Role of advanced glycation end products in hypertension and atherosclerosis:therapeutic implications［J］.Cell Biochem Biophys，2007，49（1）:48-63.

［13］鄭超，文格波，曹仁賢，等.糖基化終末產(chǎn)物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡及其受體表達的影響［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2003，19（2）:115-118.

（編輯陳明偉）

Experimental Study of Danzhi Jiangtang Capsule for Intervention on Type 2 Diabetic Vascular Complications

SHEN An－lu，WANG Liang，PENG Dai－yin，KONG De－jia
（Anhui University of Chinese Medicine，Hefei，Anhui，230038）

［Objective］To explore the mechanism of Danzhi Jiangtang Capsule（DJC）for intervening vascular complications in type 2 diabetic rats.［Methods］The type 2 diabetic rats model was made by feeding high-sugar and high-lipid fodder and injecting streptozotocin（STZ）.Eight weeks after DJC intervention，aortic morphological changes，variation of AGEs，RAGE in aorta tissue and the level of serum VCAM-1、ICAM-1 were observed.［Results］Significant pathological changes could be seen in abdominal aortic of rats model after feeding high-sugar and high-lipid fodder and injecting STZ.There is significant increase showed in abdominal aortic AGEs，RAGE（P＜0.01）and in the levels of serumVCAM-1、ICAM-1（P＜0.01）.While improved pathological changes of abdominal aortic to varying degrees could be seen in DJC groups of each dose.There is significant decrease showed in abdominal aortic AGEs，RAGE（P＜0.05 or P＜0.01）and in the levels of serumVCAM-1、ICAM-1（P＜0.05 or P＜0.01）.［Conclusions］DJC can prevent aortic pathological damage of type 2 diabetic model rats effectively.The intervening mechanism of DJC is strongly associated with the regulation of AGEs-RAGE pathway.

Danzhi Jiangtang Capsule；AGEs-RAGE system；type 2 diabetes mellitus；vascular complications；research experiment

R285.5

A

2095-4441（2015）04-0001-04

2015-10-23

國家自然科學(xué)基金面上項目（編號:81473387）；安徽中醫(yī)藥大學(xué)青年科學(xué)研究基金（編號:2013qn003）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（編號:AH201310369199）

沈安魯（1981-），男，安徽六安人，講師，碩士，研究方向:中藥藥理

彭代銀，E-mail:pengdy@ahtcm.edu.cn