魚(yú)和蝦中組胺殘留量HPLC法測(cè)定的不確定度評(píng)定

余曉薇陳俊玉王碧生方成俊潘迎芬朱惠娜肖　穎

（1.東山出入境檢驗(yàn)檢疫局　福建東山　363401；2.東山縣水產(chǎn)品檢測(cè)中心　福建東山　363401）

魚(yú)和蝦中組胺殘留量HPLC法測(cè)定的不確定度評(píng)定

余曉薇1陳俊玉1王碧生1方成俊1潘迎芬1朱惠娜2肖穎1

（1.東山出入境檢驗(yàn)檢疫局福建東山363401；2.東山縣水產(chǎn)品檢測(cè)中心福建東山363401）

利用高效液相色譜法對(duì)組胺殘留量的檢測(cè)，建立魚(yú)和蝦中組胺殘留量的不確定度分析方法，進(jìn)而對(duì)魚(yú)蝦中組胺的殘留量不確定度進(jìn)行分析評(píng)定。結(jié)果表明，HPLC法測(cè)定添加水平50mg/kg的組胺殘留量的結(jié)果可表示為：X=（48.97±3.98）mg/kg，包含因子k=2。

組胺高效液相色譜法不確定度

生物胺是一種由氨基酸在脫羧酶的作用下脫羧后形成的具有生物活性的低分子堿性含氮化合物。少量的生物胺對(duì)人體具有著重要的生理作用，但過(guò)量的攝取會(huì)引起不良反應(yīng)，如嘔吐、頭暈、心悸、呼吸困難和高血壓等。組胺是生物胺的一種，其對(duì)動(dòng)物毒害作用最強(qiáng)［1］。水產(chǎn)品尤其是一些青皮紅肉魚(yú)（如鮐魚(yú)、鰹魚(yú)、沙丁魚(yú)、秋刀魚(yú)和鯖魚(yú)等），其產(chǎn)品腐敗或放置較長(zhǎng)時(shí)間后可產(chǎn)生大量的組胺。因此，一些國(guó)家建議用組胺含量作為水產(chǎn)品中微生物腐敗的指標(biāo)［2］。組胺的衛(wèi)生學(xué)毒性問(wèn)題已受到廣泛的重視，許多國(guó)家和地區(qū)制定了水產(chǎn)品中的組胺限量標(biāo)準(zhǔn)。澳大利亞和歐盟規(guī)定水產(chǎn)品及其制品中組胺限量標(biāo)準(zhǔn)不得超過(guò)100mg/kg，美國(guó)食品藥物管理局（FDA）規(guī)定水產(chǎn)品中組胺含量不得超過(guò)50mg/kg［3］，而我國(guó)規(guī)定鮐魚(yú)中組胺含量不得超過(guò)1 000 mg/kg，其他紅肉魚(yú)類(lèi)中組胺含量不得超過(guò)300 mg/kg［4］。對(duì)魚(yú)蝦中的組胺含量的檢測(cè)對(duì)產(chǎn)品的貨架期及安全質(zhì)量指標(biāo)確定具有十分重要的意義。該文對(duì)魚(yú)和蝦中組胺的殘留量的不確定度進(jìn)行分析。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Mettler XS205DU分析天平（瑞典梅特勒公司）；BS 2202S電子天平（北京賽多利斯有限公司）；T25 basic高速均質(zhì)器（德國(guó)I-KA實(shí)驗(yàn)儀器公司）；L530臺(tái)式低速離心機(jī) （湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；SHP-1500低溫生化培養(yǎng)箱 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；XK96-A快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）。甲醇、乙腈、丙酮、乙酸銨均為色譜純（美國(guó)Tedia公司）；高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氨水均為優(yōu)級(jí)純；丹酰氯：純度≥99%；鹽酸組胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度≥99.0%（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01 657 g鹽酸組胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容至刻度，得到濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；吸取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL棕色容量瓶中，并用高氯酸定容，得到濃度為4.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，然后按照1.2.2的衍生化步驟反應(yīng)處理后供HPLC測(cè)定。

1.2.2前處理方法提?。悍Q(chēng)取2 g已絞碎試樣（精確至0.01 g）置于50 mL具塞塑料離心管中，加入10mL 0.4mol/L高氯酸溶液，振蕩混勻60 s，超聲提取10 min后，于4 000 r/min離心5 min，定容至刻度。上清液移入25 mL棕色容量瓶中。沉淀物用10 mL 0.4mol/L高氯酸溶液重復(fù)提取一次，于4 000 r/ min離心5min，合并上清液于上述容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定衍生化 移取上述提取液1.0mL 于5 mL棕色容量瓶中，依次加入100μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、300μL飽和碳酸氫鈉溶液和2 mL 10mg/mL丹酰氯溶液，蓋塞混勻，于40℃避光反應(yīng)45 min。反應(yīng)完畢后，加入100μL氫氧化銨，靜置30 min，用乙腈定容至刻度，混勻后，取部分溶液過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜后，供HPLC測(cè)定。檢測(cè)流程見(jiàn)圖1。

圖1　檢測(cè)流程示意圖

1.2.3色譜條件色譜柱：Agilent ZorbaxSB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.01 mol/L乙酸銨溶液-乙腈（體積比43∶57）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

2　不確定度評(píng)定與合成

根據(jù)數(shù)學(xué)模型和檢測(cè)流程等相關(guān)信息［5］，影響測(cè)定各個(gè)參數(shù)不確定度的來(lái)源可構(gòu)建魚(yú)和蝦組胺殘留測(cè)定的因果關(guān)系圖見(jiàn)圖2。

2.1重復(fù)測(cè)量樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的相對(duì)不確定度u rel（A）

2.1.1樣品重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的相對(duì)不確定度 urel（Ax）在2.00 g陰性樣品中，加入100μL 1.0mg/kg組胺制成加標(biāo)樣，添加水平為50mg/kg。20次測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。

自由度f(wàn)=20-1=19，靈敏系數(shù)=1。

表1　添加水平為50 mg/kg的20次測(cè)量結(jié)果

圖2　魚(yú)和蝦組胺殘留測(cè)定的因果關(guān)系圖

2.2組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引起的相對(duì)不確定度urel（B1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程：準(zhǔn)確稱(chēng)取16.57mg的鹽酸組胺標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解后定容到10 mL容量瓶，此溶液為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mg/mL；從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中吸取1 mL至25 mL棕色容量瓶中，并用高氯酸定容，此溶液為標(biāo)準(zhǔn)使用液0.004mg/L。用標(biāo)準(zhǔn)使用液0.004mg/ L衍生后，上機(jī)檢測(cè)以制得濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2.2配制標(biāo)準(zhǔn)溶液體積引入的相對(duì)不確定度urel（V）

2.3樣品稱(chēng)量引入的相對(duì)不確定度urel（B2）樣品稱(chēng)取2 g，稱(chēng)樣天平（賽多利斯2202S）稱(chēng)量不確定度主要為稱(chēng)量變動(dòng)性，根據(jù)電子天平技術(shù)參數(shù)，其變動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01 g，實(shí)際操作過(guò)程中控制在0.02 g，按照均勻分布則其不確定度為為0.02/31/2= 0.0115，則樣品稱(chēng)量的相對(duì)不確定度為：urel（B2）= 0.0115/2.00=0.0058。

2.4配制樣品溶液體積引入的相對(duì)不確定度urel（B3）

則1.00mL刻度吸管的合成體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（V3'）=8.67×10-3。

3　結(jié)　果

將A類(lèi)和B類(lèi)的相對(duì)不確定度進(jìn)行合成［7］，檢測(cè)結(jié)果Cx為48.9655mg/kg。

U=k uc，取包含因子k＝2（置信水平0.95），則：U=kuc=3.98mg/kg。

根據(jù)以上分析，HPLC法測(cè)定添加水平50 mg/ kg的組胺殘留量的結(jié)果可表示為：X=（48.97±3.98）mg/kg，包含因子k=2。

［1］趙利，蘇偉，劉建濤，等.水產(chǎn)品中生物胺的研究進(jìn)展［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào).2006.30（2）：272-276.

［2］郝宏蘭.水產(chǎn)品中組胺的測(cè)定方法研究 ［J］.食品科學(xué)，2000，21（8）：46-48.

［3］李志軍，薛長(zhǎng)湖，封錦芳，等.柱前衍生-RP-HPLC方法測(cè)定水產(chǎn)品中生物胺 ［J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，37（3）：427-431.

［4］GB 2733-2005鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

［5］GB/T20768-2006魚(yú)和蝦中有毒生物胺的測(cè)定-液相色譜紫外檢測(cè)法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

［6］中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南［M］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2002.

［7］國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計(jì)量司.測(cè)量不確定度的評(píng)定與表示指南［M］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2000.

Evaluation of uncertainty for determ ining of histam ine in fish and shrimp by HPLC

Yu Xiaowei1Chen Junyu1Wang Bisheng1Fang Chengjun1Pan Yingfen1Zhu Huina2Xiao Ying1
（1.Dongshan Entry&Exit Ispection and Quarantine Bureau，F(xiàn)ujian 363401；2.Dongshan Aquatic Products Test Center，F(xiàn)ujian 363401）

Establish the evaluation of the uncertainty of histamine in fish and shrimp by HPLC.The result showed that∶histamine can be expressed by X=（48.97±3.98）mg/kg ataddition level of 50mg/kg by using a coverage factor k=2.

Histamine HPLC Uncertainty

A

1003-4331（2015）01-0003-04

福建省出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目（FK2012-13）資助。

余曉薇，女，福建寧德人，從事食品檢測(cè)工作。