仁栝樓一步成苗離體快繁技術(shù)△

榮俊明，韓琳娜，郭慶梅

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

·中藥農(nóng)業(yè)·

仁栝樓一步成苗離體快繁技術(shù)△

榮俊明，韓琳娜*，郭慶梅*

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

目的：為解決仁栝樓種苗的大量需求及繁育繁瑣問題。方法：利用仁栝樓的腋芽作為外植體，進(jìn)行一步成苗離體培養(yǎng)。結(jié)果：篩選出最佳一步成苗培養(yǎng)基為 MS+0.1 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，植株再生頻率達(dá) 5.4。壯苗后的仁栝樓組織培養(yǎng)苗可直接移栽到育苗基質(zhì)中，成活率可達(dá)77.1%。結(jié)論：仁栝樓一步成苗離體培養(yǎng)技術(shù)大大縮短了育苗周期。

仁栝樓；組織培養(yǎng)；一步成苗

栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim，為葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物，其根(中藥名天花粉)、種子(中藥名栝樓仁)、果實(shí)(中藥名栝樓實(shí))、果皮(中藥名栝樓皮)均可入藥，有潤肺祛痰、滑腸散結(jié)的功能[1-2]。特別是天花粉目前已被用于引產(chǎn)，治療葡萄胎、惡性葡萄胎和宮外孕[3]。仁栝樓是山東栽培栝樓的優(yōu)良農(nóng)家品種，也是GAP研究的首選品種[4]。因?yàn)槿疏闃怯猛緩V，目前種植方法得到的產(chǎn)量已經(jīng)滿足不了市場(chǎng)日益增長(zhǎng)的需求，鑒于栝樓繁育困難，可借助組織培養(yǎng)技術(shù)來解決此問題[5]。通過愈傷組織得到再生植株的組培技術(shù)，前人已經(jīng)做了大量研究，但對(duì)仁栝樓組培快繁一步成苗技術(shù)尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，通過篩選不同激素組合誘導(dǎo)仁栝樓一步成苗的最佳培養(yǎng)基，探索出不經(jīng)過愈傷組織這一環(huán)節(jié)的一步成苗快速繁殖培養(yǎng)方法，可以大大縮短組培時(shí)間，節(jié)省成本，提高成活率，盡快解決現(xiàn)在市場(chǎng)對(duì)種苗的需求。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)用仁栝樓來源于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥圃，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定為葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim)，5月初從長(zhǎng)勢(shì)良好的植株上取當(dāng)年生的嫩腋芽做外植體。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 無菌外植體的獲得 外植體準(zhǔn)備：剪取2 cm左右的栝樓嫩腋芽用2% 餐洗凈洗去灰塵后流水沖洗10 min，置于超凈工作臺(tái)上。75%乙醇浸泡外植體1 min，無菌水沖洗；0.1% 升汞(含吐溫-20)消毒3 min，無菌水沖洗5～6次，無菌濾紙吸干水分，備用。

1.2.2 一次性成苗培養(yǎng)基的確定 以MS為基本培養(yǎng)基，分別附加 6-BA 0.1、0.2、0.5 mg·L-13個(gè)水平，NAA0.1、0.2 mg·L-12個(gè)濃度水平進(jìn)行試驗(yàn)，共組成6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基平行5瓶，每個(gè)三角瓶接種3個(gè)外植體，觀測(cè)并統(tǒng)計(jì)每種培養(yǎng)誘導(dǎo)外植體一次成苗的結(jié)果，確定一步成苗培養(yǎng)基最適配方。

1.2.3 培養(yǎng)條件 外植體常規(guī)消毒后，接種于100 mL三角瓶?jī)?nèi)，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：pH 5.8，瓊脂濃度0.7%，蔗糖含量3%，培養(yǎng)溫度25±1 ℃，光照強(qiáng)度2500 Lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

1.2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì) 對(duì)接種后植株觀察其愈傷組織形態(tài)學(xué)變化。在接種后20 d觀察葉片大小、葉色、生長(zhǎng)速度，測(cè)量試管苗高度。接種后 60 d統(tǒng)計(jì)再生植株頻率、根長(zhǎng)度和主根數(shù)量，再生植株頻率=再生植株總數(shù)/接種的外植體數(shù)[6]。

2 結(jié)果和分析

2.1 愈傷組織形態(tài)學(xué)觀察

在培養(yǎng)過程中，無論能否誘導(dǎo)愈傷組織，葉片均能保持一段時(shí)間鮮綠。4～5 d 后，能夠發(fā)生愈傷組織的外植體，與培養(yǎng)基接觸的部分向上拱起 。10 d左右外植體邊緣開始出現(xiàn)顆粒狀膨大，隨后瘤狀突起向周圍擴(kuò)展，15 d 左右形成明顯可見的愈傷組織，顏色為淺黃色。此時(shí)，仍有一些外植體，雖然仍是綠色，卻不能形成愈傷組織。20 d 左右，愈傷組織進(jìn)一步膨大，表面粗糙如蘑菇云狀(圖1)。愈傷組織的顏色逐漸變深，說明15～20 d，為愈傷組織生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，最宜進(jìn)行愈傷組織的繼代培養(yǎng)。若不轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，35 d左右愈傷組織塊底部長(zhǎng)出白色絨毛細(xì)根，50 d左右形成根葉完整的一體苗 。

2.2 不同激素和濃度配比對(duì)仁栝樓一步成苗的影響

將仁栝樓嫩芽外植體接種在含 6種激素的 MS 培養(yǎng)基上，其一步成苗的結(jié)果見表1。6-BA濃度較高的 2號(hào)、4號(hào)和6號(hào)培養(yǎng)基葉片較小，顏色較淺，生長(zhǎng)緩慢且較矮小。而1號(hào)、3號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)基葉片較大，顏色較深，生長(zhǎng)較快并且長(zhǎng)勢(shì)較高，尤其5號(hào)培養(yǎng)基植株長(zhǎng)勢(shì)最好(圖2、3)。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)仁栝樓再生苗的影響 (n=15)

圖1 4號(hào)培養(yǎng)基接種20 d生長(zhǎng)情況

圖2 5號(hào)培養(yǎng)基接種60 d生長(zhǎng)情況

圖3 1號(hào)培養(yǎng)基接種60 d生長(zhǎng)情況

2.3 不同激素濃度對(duì)仁栝樓再生和生根情況的影響

接種后30 d時(shí)，栝樓試管苗開始長(zhǎng)出大量的白根，同時(shí)成長(zhǎng)的茁壯的植株速度減慢。1號(hào)、2號(hào)、6號(hào)主根個(gè)數(shù)較少，生長(zhǎng)緩慢，隨著NAA濃度增加和6-BA濃度減小，3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)培養(yǎng)基的根個(gè)數(shù)增多，并且生長(zhǎng)速度快長(zhǎng)勢(shì)較好(圖4，圖5)。5號(hào)培養(yǎng)基其地上部和根部均有旺盛的長(zhǎng)勢(shì)，且植株再生頻率高。接種后60 d栝樓苗的生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。通過對(duì)比認(rèn)為，6種培養(yǎng)基中，以5號(hào)培養(yǎng)基MS+0.1 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA為仁栝樓最合適的一步成苗培養(yǎng)基。

2.4 煉苗與移栽

當(dāng)試管苗生長(zhǎng)出發(fā)達(dá)的根系。將試管苗從人工培養(yǎng)箱移至自然條件下，1 d后松開瓶口，3 d后打開瓶蓋煉苗，7 d后取出試管苗洗去根部培養(yǎng)基栽入育苗基質(zhì)中，注意保持一定的濕度。30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率為77.1%。移栽成活后植株如圖6。

圖4 6號(hào)培養(yǎng)基接種30 d根生長(zhǎng)情況

圖5 5號(hào)培養(yǎng)基接種30 d根生長(zhǎng)情況

圖6 移栽后15 d生長(zhǎng)情況

3 討論

通常栝樓傳統(tǒng)生產(chǎn)繁殖靠種子、分株等方法，在很大程度上限制了大面積的推廣栽培，進(jìn)行離體高效快繁可以解決這一問題。通過愈傷組織再分化芽苗途徑可以有效的提高增殖系數(shù)，但外植體誘導(dǎo)愈傷組織的周期較長(zhǎng)、獲得不定芽速度較慢、試驗(yàn)次數(shù)較多，且愈傷組織長(zhǎng)期連續(xù)增殖極易發(fā)生退化和變異等缺點(diǎn)。因此，相對(duì)于愈傷組織再分化芽苗來說，腋芽增殖并同時(shí)生根這一途徑，不僅成苗速度快，繁殖系數(shù)高，而且遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，能在短期內(nèi)獲得大量良種苗，有效解決良種苗匱乏的現(xiàn)狀。

在實(shí)際的生產(chǎn)過程中，普通快繁需要經(jīng)過誘導(dǎo)、繼代、壯苗和生根四個(gè)階段的培育，且分別使用不同的培養(yǎng)基。如果用一種或兩種培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)四個(gè)階段的培養(yǎng)，得到移栽苗，既可簡(jiǎn)化生產(chǎn)程序，提高培養(yǎng)效率，又能縮短育苗周期，降低生產(chǎn)成本。這也是衡量培養(yǎng)基配方是否理想的重要標(biāo)準(zhǔn)。

本研究建立了由腋芽再生完整植株的栝樓一步成苗快速繁殖體系，從接種外植體到試管苗僅需60天，將傳統(tǒng)組培快繁技術(shù)育苗周期縮短一半?？稍诙虝r(shí)間內(nèi)大量繁殖栝樓種苗，為栝樓種植業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)種苗。且其方法簡(jiǎn)捷，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可操作性強(qiáng)。因此可進(jìn)行推廣使用以及工業(yè)化生產(chǎn)，達(dá)到快速增殖的目的。

致謝：本項(xiàng)目在山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練平臺(tái)完成，獲得學(xué)校2013年度大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃(SRT)項(xiàng)目立項(xiàng)資助，項(xiàng)目編號(hào)2013266；韓琳娜博士為本項(xiàng)目指導(dǎo)教師。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1996：244-245.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：104-105.

[3] 姚紅麗，仝進(jìn)毅.天花粉蛋白在婦產(chǎn)科臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合，2013，23(11)：954-956.

[4] 郭慶梅，周鳳琴，李定格等.瓜蔞的名稱、原植物和產(chǎn)地的本草考證[J].中醫(yī)研究，2006，19(3)：28-29.

[5] 高麗紅.栝樓愈傷組織的培養(yǎng)[J].科苑觀察，2010，23(05)：27-28.

[6] 曾愛松，宋立曉，高兵等.結(jié)球甘藍(lán)小孢子胚植株再生體系的優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29(1)：228-230.

In-vitroRegenerationofOneStepSeedlingsforTrichosantheskirilowiiMaxim.

RONGJunming，HANLinna*，GUOQingmei*

(CollegeofPharmacy，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China)

To solve the problems of breeding and the large demand of seedling ofTrichosantheskirilowii，a fast regeneration system of one step seedlings was established forT.kirilowii.The optimum regeneration medium was MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1and the plant regeneration frequency reached 5.4.The survival rate of seedling transplanting could reach 77.1%.The technology of one-step seedlings forT.kirilowiican shorten the breeding cycle greatly.

TrichosantheskirilowiiMaxim；tissue culture；one-step seedling breeding

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.012

2014-11-26)

山東省科技發(fā)展計(jì)劃2011GSF11094

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韓琳娜，博士，副教授，研究方向?yàn)榉肿由帉W(xué)，E-mail：linnahan@163.com 郭慶梅，教授，博士，主要從事中藥質(zhì)量控制與資源的研究，E-mail: qmguo@sina.com