民族藥蔓菁對肺炎鏈球菌和流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用△

李張宇，萬波，王張*，張穎，李博，桑勤，白成陽，任志麗，繆舒益，唐光曦

(1.太極集團(tuán)有限公司，重慶 401147；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

·基礎(chǔ)研究·

民族藥蔓菁對肺炎鏈球菌和流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用△

李張宇1，萬波2，王張2*，張穎1，李博2，桑勤1，白成陽2，任志麗2，繆舒益2，唐光曦2

(1.太極集團(tuán)有限公司，重慶 401147；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

目的：研究民族藥蔓菁的在體抗菌、抗病毒作用，進(jìn)而揭示其治療“肺燥咳嗽”的機制。方法：按照傳統(tǒng)方法制備蔓菁膏，觀察其低、中、高3個劑量[劑量分別為250、500、1000 mg(浸膏)·(kg·d)-1]對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感病毒感染致小鼠死亡及肺指數(shù)的影響。結(jié)果：蔓菁膏3個劑量對金黃色葡萄球菌感染小鼠均沒有明顯的保護(hù)作用，但對小鼠小腸炎性病變具有一定的緩解作用；蔓菁膏3個劑量均可降低肺炎鏈球菌致小鼠感染死亡率(由90%降至15%～30%)，中劑量效果最佳(死亡率為15%)；蔓菁膏低、高劑量還能減輕流感病毒性小鼠肺炎的充血水腫實變并降低肺指數(shù)，其肺指數(shù)抑制率分別為29.23%、28.38%，低劑量效果最佳，中劑量沒有明顯的作用。結(jié)論：蔓菁膏對肺炎鏈球菌和流感病毒感染小鼠具有保護(hù)作用，量效關(guān)系不成線性，為其臨床應(yīng)用于治療“肺燥咳嗽”提供參考。

蔓菁；肺炎鏈球菌；金黃色葡萄球菌；流感病毒；小鼠；肺燥咳嗽

蔓菁為十字花科植物蕪菁BrassicarapaL.的塊根，有藏族、維吾爾族、普米族藥用歷史[1]。藏藥名為妞瑪、熊麻，制成蔓菁膏，治“龍”病、“培根”病和中毒等[2]；維吾爾藥名為查木古爾、恰瑪古爾，治體虛陽痿、營養(yǎng)不良、肺燥咳嗽等[3]。急性氣管支氣管炎是由病毒(腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒)或細(xì)菌(流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、鏈球菌、葡萄球菌)等病原體感染所致的支氣管黏膜炎癥，癥見咳嗽、咯痰[4]。本文擬通過研究蔓菁的在體抗菌、抗病毒作用，進(jìn)而揭示蔓菁治療“肺燥咳嗽”的機制。

1 材料與儀器

1.1 藥物

蔓菁樣品采自四川省松潘縣紅土鄉(xiāng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝研究員鑒定為十字花科植物蕪菁BrassicarapaL.的塊根。將其切片后，于60 ℃烘干，加10倍量水，煎煮4次，每次1 h，第一次加水后浸泡1 h，合并提取液，濾過，濃縮，即得蔓菁膏[5]，每克浸膏含1.55 g原生藥材。用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50 mg(浸膏)·mL-1的溶液。雙黃連口服液，由哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司生產(chǎn)，用蒸餾水配置成濃度為0.5 mL(口服液)·mL-1的溶液。頭孢拉定膠囊，由江蘇亞邦強生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為16.67 mg·mL-1的溶液。利巴韋林片，由四川美大康藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為3.75 mg·mL-1的溶液。

1.2 動物

SPF級KM種小鼠，488只，雌雄各半，體重(20±2)g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-24。

1.3 菌株和病毒株

金黃色葡萄球菌臨床分離株MSSA05-4和肺炎鏈球菌臨床分離株S-1，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供；鼠流感病毒FM1株，由四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.4 試劑和儀器

雞胚(10日齡雞胚，質(zhì)量要求：禽流感抗體陰性)；牛肉膏、蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號分別為20031015，20070102)；pH計(PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司，編號：023443)；Forma Orbital Shake(Thermo Electron Corporation，Model：481，S/N：101596-160)；WH-2微型旋渦混合儀(上海瀘西分析儀器廠)；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器械廠)；生化培養(yǎng)箱(KXB-150型，成都科析儀器成套公司)；凈化工作臺(SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；電子分析天平[AB204-N型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 金黃色葡萄球菌感染小鼠模型

2.1.1 菌株毒力測試 金黃色葡萄球菌臨床分離株MSSA05-4接種于平板培養(yǎng)基，并制備肉湯培養(yǎng)基(液體)和瓊脂培養(yǎng)基(固體)，然后在超凈工作臺上進(jìn)行肉湯培養(yǎng)基接種、細(xì)菌計數(shù)，并計算菌落濃度。取小鼠36只，雌雄各半，隨機分成6組(5個細(xì)菌濃度組，一個空白對照組)，每組6只。考慮到細(xì)菌毒力不夠，或小鼠本身對該菌不敏感，本實驗采用5%干酵母配制菌懸液而降低小鼠的抵抗力。取6支試管(實際用5支并標(biāo)號10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，各加入4.5 mL5%干酵母0.9%氯化鈉溶液，高溫滅菌10 min后，以0.5 mL細(xì)菌原液與4.5 mL的5%干酵母溶液混合，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個不同濃度的菌懸液，各5 mL，完畢后置于冰箱4 ℃保藏。腹腔注射時，先用碘酒消毒后，5個濃度組分別注射5個濃度的菌懸液，空白對照組注射5%的干酵母0.9%氯化鈉溶液，每只小鼠均腹腔注射0.5 mL。仔細(xì)觀察并記錄小鼠在48 h內(nèi)的反應(yīng)情況和死亡數(shù)[6]。

2.1.2 在體抗菌實驗 小鼠隨機分組，連續(xù)灌胃給藥3 d，每天1次，給藥體積均為20 mL·(kg·d)-1。末次給藥后30 min，根據(jù)菌株毒力測試結(jié)果選用使80%～100%小鼠死亡的金黃色葡萄球菌的干酵母懸液(菌落濃度為9.2×105CFU·mL)0.5 mL，給小鼠腹腔注射，造成感染(空白對照組注射等量干酵母0.9%氯化鈉溶液)。感染后6 h再給藥1次，觀察和記錄各組小鼠感染后7 d內(nèi)的反應(yīng)情況以及死亡數(shù)。

2.2 肺炎鏈球菌感染小鼠模型

2.2.1 菌株毒力測試 同2.1.1[7]。

2.2.2 在體抗菌實驗 分組和給藥同2.1.2。末次給藥后30 min，根據(jù)菌株毒力測試結(jié)果選用使80%～100%小鼠死亡的肺炎鏈球菌的干酵母懸液(菌落濃度為6.3×106CFU·mL-1)0.5 mL，給小鼠腹腔注射，造成感染(空白對照組注射等量干酵母0.9%氯化鈉溶液)。感染后6 h再給藥1次，觀察和記錄各組動物感染后7 d內(nèi)的反應(yīng)情況以及死亡數(shù)。

2.3 流感病毒感染小鼠模型

2.3.1 病毒擴增 將流感病毒液解凍，0.9%氯化鈉溶液100倍稀釋，無菌條件下尿囊腔接種，0.2 mL/胚，36～37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h照蛋，棄死亡雞胚，存活雞胚繼續(xù)孵育，每隔6 h照蛋1次，死亡雞胚0～4 ℃冷藏保存。3 d后，將所有雞胚置0～4 ℃冷藏12～24 h，無菌條件下收集雞胚尿囊液，經(jīng)無菌檢驗合格后，冷凍保存?zhèn)溆肹8]。

2.3.2 病毒的血凝效價(HA) 以試管稀釋法將病毒液做對倍系列稀釋，加入0.7%雞紅細(xì)胞懸液混勻，室溫靜置0.5～1 h，待陰性對照管管底形成紅細(xì)胞沉積點，觀察，以出現(xiàn)血凝陽性的最高病毒稀釋度的倒數(shù)作為病毒血凝價。最后測得病毒血凝價為512。

2.3.3 小鼠的半數(shù)致死量(LD50) 用0.9%氯化鈉溶液對病毒液做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋，每項稀釋度滴鼻50 μL，感染小鼠10只，對照組滴鼻等量0.9%氯化鈉溶液。感染后，每天記錄小鼠發(fā)病死亡數(shù)，觀察14 d，計算LD50[9]。測得病毒對小鼠LD50為10-3.75，即病毒液的毒價為103.75LD50·mL-1。

2.3.4 感染病毒 小鼠隨機分組后預(yù)防性灌胃給藥3 d，每天1次，給藥體積均為20 mL·(kg·d)-1。末次給藥后0.5～1 h進(jìn)行病毒感染，感染病毒量為20 LD50·0.05 mL-1，即病毒液做14倍稀釋，每鼠滴鼻感染0.05 mL，空白對照組用等量0.9%氯化鈉溶液滴鼻。感染后再連續(xù)給藥4 d，末次給藥后1 h處死小鼠。剪開胸腔取出全肺，計算肺指數(shù)和抑制率，肺指數(shù)(%)=[肺重(g)/體重(g)]×100%；肺指數(shù)抑制率(%)=[(模型對照組平均肺指數(shù)-實驗組平均肺指數(shù))/模型對照組平均肺指數(shù)]×100%。

2.4 統(tǒng)計方法

運用SPSS 17.0 for windows軟件提供的單因素方差分析或非參數(shù)檢驗方法對計量資料和計數(shù)數(shù)據(jù)的組間差異進(jìn)行顯著性檢驗。

3 結(jié)果

3.1 對金黃色葡萄球菌感染小鼠的影響

3.1.1 細(xì)菌計數(shù) 本實驗取用10-7兩個培養(yǎng)皿生長菌落數(shù)的平均值為計量值，結(jié)果為：[(91+93)/2]×107×10=9.2×109CFU·mL-1，即為菌原液的菌落濃度。見表1。

表1 金黃色葡萄球菌計數(shù)結(jié)果

3.1.2 菌株毒力測試結(jié)果 10-4稀釋濃度的菌液(即菌落濃度為9.2×105CFU·mL-1)致死率為85.7%，符合致死率在80%～100%之間試驗菌液感染要求，確定為本次實驗感染的菌落濃度。見表2。

表2 金黃色葡萄球菌致小鼠死亡的菌落濃度預(yù)試結(jié)果

3.1.3 在體抗菌實驗結(jié)果 蔓菁3個劑量對金黃色葡萄球菌感染小鼠沒有明顯的保護(hù)作用，但對小鼠小腸炎性病變具有一定的緩解作用。一般反應(yīng)情況：各實驗組小鼠在感染當(dāng)天腹腔注射后1 min左右，均出現(xiàn)典型的扭體反應(yīng)(包括空白對照組)，感染后小鼠活動減少，幾乎不進(jìn)食，見蜷臥、弓背等現(xiàn)象。感染后第2天，小鼠出現(xiàn)集中死亡，死亡小鼠肛門有黑色排泄物粘附，存活小鼠大多見排稀便現(xiàn)象，小鼠束毛、形態(tài)萎靡。感染后第3天，存活小鼠的進(jìn)食量開始增加，健康狀況有恢復(fù)跡象，3 d之后小鼠鮮有死亡。感染后第7天，處死小鼠，所有存活小鼠體重均有不同程度的減輕。尸解發(fā)現(xiàn)，模型對照組小鼠小腸全段壞死，而在其他給藥組，只有十二指腸段壞死，且肺部未見明顯的異常病變。見表3。

表3 蔓菁對金黃色葡萄球菌感染小鼠的影響實驗結(jié)果

注：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；蔓菁的劑量以蔓菁浸膏計。下同。

3.2 對肺炎鏈球菌感染小鼠的作用

3.2.1 細(xì)菌計數(shù) 本實驗取用10-8兩個培養(yǎng)皿生長菌落數(shù)的平均值為計量值，結(jié)果為：[(62+64)/2]×108×10=6.3×1010CFU·mL-1，即為菌原液的菌落濃度。見表4。

表4 肺炎鏈球菌計數(shù)結(jié)果

3.2.2 菌株毒力測試結(jié)果 10-4稀釋濃度的菌液(即菌落濃度為6.3×106CFU·mL-1)致死率為85.7%，符合致死率在80%～100%之間試驗菌液感染要求，確定為本次實驗感染的菌落濃度。見表5。

表5 肺炎鏈球菌致小鼠死亡的菌落濃度預(yù)試結(jié)果

3.2.3 在體抗菌實驗結(jié)果 蔓菁膏3個劑量均可降低肺炎鏈球菌致小鼠感染死亡率(由90%降至15%～30%)，中劑量效果最佳(死亡率為15%)。一般反應(yīng)情況：各實驗組小鼠在感染當(dāng)天腹腔注射后1 min左右，與注射金黃色葡萄球菌后的反應(yīng)有區(qū)別，未出現(xiàn)典型的扭體反應(yīng)，動物在感染后數(shù)分鐘出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮的癥狀，明顯狂躁、抽搐、步態(tài)不穩(wěn)、豎尾，之后興奮癥狀消失，但活動減少，幾乎不進(jìn)食，見蜷臥、弓背等現(xiàn)象。感染后第2天，小鼠出現(xiàn)集中死亡，存活小鼠則形態(tài)萎靡。感染后3 d，存活小鼠進(jìn)食開始增加，健康狀況見有恢復(fù)跡象，3 d之后小鼠鮮有死亡。感染后7 d，處死小鼠，所有存活小鼠體重均有不同程度的減輕。尸解發(fā)現(xiàn)，模型對照組小鼠的肺部有明顯的炎性病變，而其他給藥組小鼠的肺部病變則不明顯。見表6。

表6 蔓菁對肺炎鏈球菌感染小鼠的保護(hù)作用實驗結(jié)果

3.3 對流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用

蔓菁膏低、高劑量還能減輕流感病毒性小鼠肺炎的充血水腫實變并降低肺指數(shù)，低、高劑量組的肺指數(shù)抑制率分別為29.23%、28.38%，低劑量效果最佳，中劑量沒有明顯的作用。見表7。

表7 蔓菁對流感病毒性小鼠肺炎的保護(hù)作用實驗結(jié)果

4 討論

4.1 蔓菁的現(xiàn)代研究進(jìn)展

蔓菁的原植物蕪菁BrassicarapaL.為2年生草本，人工栽培歷史悠久，原產(chǎn)歐洲，現(xiàn)亞洲和美洲均有栽培。國內(nèi)廣泛種植，如西藏拉薩市近郊、山南地區(qū)各縣均有分布，四川省主要栽培在涼山州、甘孜州、阿壩州等高寒民族山區(qū)，新疆南部亦有廣泛種植[10]。蔓菁具有抗缺氧[11]、提高免疫[12]、抗衰老[13]等藥理作用。蔓菁主要含黃酮類[14](槲皮素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷等)、多糖類[15]、揮發(fā)油類[16](軟脂酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸及芥酸等)、氨基酸類[17](蘇氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、胱氨酸、色氨酸、異亮氨酸等)等化學(xué)成分。

《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》1995年版(藏藥·第一冊)[18]和《西藏自治區(qū)藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》[19]均收載有蔓菁膏，前者僅有“蔓菁膏為十字花科植物蕪菁(蔓菁)的根熬制的浸膏”的簡單描述，后者對蔓菁膏進(jìn)行了鑒別項下的薄層鑒別和檢查項下的水分測定?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》1998年版(維吾爾藥分冊)[20]將蕪菁子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收入正文，主要對其進(jìn)行了鑒別項下的顯微鑒別和薄層鑒別。本課題組開展了蔓菁膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究，建立了TLC、水分、總灰分、水中不溶物、含量測定等質(zhì)量控制方法[21]，并被收錄入即將出版的《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》中。

4.2 蔓菁在體抗病原微生物作用的特點

藥物的體內(nèi)抗菌、抗病毒試驗不僅能反映藥物對細(xì)菌的直接作用，還能反映藥物對機體反應(yīng)性的影響，特別是對非特異性抵抗力的影響，但是中藥直接對抗病原微生物導(dǎo)致動物死亡的作用較弱[22]，主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，作用靶點不僅為機體免疫系統(tǒng)[23]。

蔓菁膏對肺炎鏈球菌小鼠具有保護(hù)作用，可明顯降低肺炎鏈球菌致小鼠感染死亡率，這在中藥和民族藥的在體抗病原微生物研究中還是不多見的；蔓菁膏能減輕流感病毒感染導(dǎo)致的小鼠肺炎充血水腫實變，保護(hù)作用有限，為其臨床應(yīng)用于治療“肺燥咳嗽”提供了藥理學(xué)依據(jù)；蔓菁膏對金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護(hù)作用不明顯。

蔓菁膏3個劑量的量效關(guān)系不成線性，可能與劑量設(shè)置數(shù)較少有關(guān)。蔓菁膏3個劑量均可降低肺炎鏈球菌致小鼠感染死亡率(由90%降至15%～30%)，中劑量效果最佳(死亡率為15%)，低劑量和高劑量者均為30%；蔓菁膏低、高劑量還能減輕流感病毒性小鼠肺炎的充血水腫實變并降低肺指數(shù)，低、高劑量組的肺指數(shù)抑制率分別為29.23%、28.38%，低劑量效果最佳，中劑量沒有明顯的作用(11.50%)。

4.3 蔓菁在體抗病原微生物作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析

1969年，世界權(quán)威科學(xué)雜志“Nature”首次發(fā)文闡述了香菇多糖的抗腫瘤作用。隨后，中藥中多糖的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗病毒、保護(hù)胃腸系統(tǒng)等多種生物學(xué)活性逐漸被證實，如枸杞多糖、靈芝多糖、灰樹花多糖、銀耳多糖、熟地多糖、麥冬多糖等[24]。

本課題組測得蔓菁多糖含量的平均值為28.22%[21]，故推測蔓菁膏治療急性支氣管炎的機制可能主要不是抗病原微生物，而與調(diào)節(jié)免疫、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、緩解支氣管痙攣等藥理作用有關(guān)[25]，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能為蔓菁多糖。因此，結(jié)合血清藥物化學(xué)方法，開展蔓菁膏及其多糖的止咳、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等研究，有望揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。

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ProtectiveEffectofEthnomedicineBrassicarapaonMiceInfectedwithStreptococcusPneumoniaeandInfluenzaVirus

LIZhangyu1，WANBo2，WANGZhang2*，ZHANGYing1，LIBo2，SANGQin1，BAIChengyang2，RENZhili2，MIAOShuyi2，TANGGuangxi2

(1.TaijigroupCo.，Ltd.，Chongqing401147，China；2.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu611137，China)

Objective：To study the antibacterial and antiviral effect of the ethnomedicineBrassicarapainvivo，and reveal its effective mechanism to treat acute bronchitis.Methods：Brassicarapawas extracted according to the traditional method，the protective effect ofB.rapaextract was studied in low，middle and high dose [250、500、1000 mg(extract)·(kg·d)-1] on mice infected with Staphylococcus aureus，Streptococcus pneumoniae and influenza virus.Results：B.rapaextract was not able to protect the mice infected with Staphylococcus aureus，but had a certain role in the mitigation of animal enteritis lesions.Brassicarapaextract，in low，middle and high dose could reduce the mortality of the mice from 90% to 15%～30%，and the mortality of the middle dose was the best(15%).B.rapaextract in low and high dose reduced congestion and edema in real variable and pulmonary index on the mice infected with influenza virus，and the lung index inhibition rate were 29.23%，28.38%，respectively.There was no significant effect in the middle dose.Conclusion：B.rapahas the protective effect on mice infected with Streptococcus pneumoniae and influenza virus，but the dose effect relationship is not linear，and the result provides scientific basis forB.rapaused for treatment of “l(fā)ung dryness cough”.

Brassicarapa；Streptococcuspneumoniae；Staphylococcusaureus；influenza virus；mice；lung dryness cough

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.006

2014-10-27)

四川省食品藥品監(jiān)督管理局科研項目(301-377)；四川省中醫(yī)藥管理局科技專項(2012-G-029)；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金(CGZH201201)

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王張，男，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：民族藥藥理學(xué)；Tel：(028)61800160，E-mail：wzcqcd@163.com