HPLC-ELSD同時測定柴胡消癭顆粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸及橙皮苷的含量

周旭，翟延君

(遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 116600)

·基礎研究·

HPLC-ELSD同時測定柴胡消癭顆粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸及橙皮苷的含量

周旭，翟延君*

(遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 116600)

目的：建立采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(HPLC-ELSD)法同時測定柴胡消癭顆粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷的含量測定方法。方法：色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.01%甲酸水溶液，梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)：漂移管溫度為60 ℃，霧化氣體為高純氮氣，氮氣壓力為3.0 MPa，Gain 6。結果：5種活性成分實現(xiàn)良好分離，柴胡皂苷a在0.21～1.64 μg線性關系良好，r=0.999 3，平均回收率為102.2%，RSD為1.5%；柴胡皂苷d在0.355～2.840 μg 線性關系良好，r=0.999 0，平均回收率為101.9%，RSD為1.5%；芍藥苷在1.20～9.60 μg線性關系良好，r=0.999 5，平均回收率為97.93%，RSD為2.2%；阿魏酸在0.140～1.120 μg線性關系良好，r=0.999 2，平均回收率為98.79%，RSD為2.7%；橙皮苷在1.00～8.00 μg線性關系良好，r=0.999 2，平均回收率為99.9%，RSD為2.6%。結論：該方法簡便、準確，重復性好，可為控制柴胡消癭顆粒的質量提供參考。

柴胡消癭顆粒；柴胡皂苷a；柴胡皂苷d；芍藥苷；阿魏酸；橙皮苷；高效液相-蒸發(fā)光散射檢測法

柴胡消癭顆粒為遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院名老中醫(yī)經驗方，由柴胡、赤芍、當歸、陳皮等8味中藥組成，方中以君藥柴胡作為肝經引經藥，疏肝解郁，使肝氣得以調達；以赤芍入肝經血分，散瘀斂陰，柔肝止痛；以陳皮疏肝理氣，健脾和中。本復方氣血兼顧，肝脾同調，軟堅散結，活血化瘀，共奏祛邪扶正、標本兼治之功能。目前，柴胡消癭顆粒未有相關分析方法的文獻報道。本試驗采用HPLC-ELSD，同時對君藥柴胡中有效成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，赤芍中有效成分芍藥苷，當歸中有效成分阿魏酸以及陳皮中有效成分橙皮苷進行含量測定，能有效控制產品的內在質量，確保用藥安全，為完善該制劑質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；G1379A真空脫氣機、G1311A四元梯度泵、G1313A自動進樣器、G1315A柱溫箱、Agilent1200 蒸發(fā)光散射檢測器，Agilent B04.03化學工作站(美國Agilent公司)；AE-240 電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KH-400DB 超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；DK-98-Ι型電熱恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥

柴胡皂苷a對照品、柴胡皂苷d對照品、芍藥苷對照品、阿魏酸對照品、橙皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110777-200507、110778-200506、110736-201136、0773-9910、110721-200211)；柴胡消癭顆粒由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中醫(yī)藥實驗中心自制，規(guī)格為15 g/袋；甲醇(HPLC級，美國賽默飛世爾科技有限公司)；水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.01%甲酸(B)梯度洗脫(0～10 min，15%→30%A；10～15 min，30%→40%A；15～18 min，40%→55%A；18～20 min，55%→60%A)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度為60 ℃，霧化氣體為高純氮氣，氮氣壓力3.0 MPa，Gain 6，過濾器3 s。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取阿魏酸對照品適量，置容量瓶中，加入70%甲醇溶解并定容，制成質量濃度為0.140 mg·mL-1的溶液；取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷及橙皮苷對照品適量，分別置容量瓶中，加入甲醇定容，分別制成質量濃度為0.205 mg·mL-1的柴胡皂苷a、0.355 mg·mL-1的柴胡皂苷d、1.20 mg·mL-1的芍藥苷、1.00 mg·mL-1的橙皮苷溶液。精密吸取上述5種對照品溶液，等比例混合，得混合對照品溶液，備用[1]。

2.3 供試品溶液制備

取柴胡消癭顆粒1袋，研細，取約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含5%氨水的甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用含5%氨水的甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液25 mL，于50 ℃減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[2-4]。

2.4 陰性供試品溶液的制備

按處方及工藝制備成不含柴胡的顆粒劑，再按2.3項下方法制備成柴胡陰性供試品溶液，同法制成赤芍、當歸及陳皮陰性供試品液，備用。

2.5 測定法

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。由色譜圖可知，供試品溶液在與對照品色譜峰相應的位置上具有相同保留時間的色譜峰，陰性供試品溶液無干擾，見圖1。

A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.柴胡陰性供試品溶液；D.赤芍陰性供試品溶液；E.當歸陰性供試品溶液；F.陳皮陰性供試品溶液；1.芍藥苷；2.阿魏酸；3.橙皮苷；4.柴胡皂苷a；5柴胡皂苷d。圖1 柴胡消癭顆粒HPLC圖

3 結果

3.1 線性關系考察

分別精密吸取混合對照品溶液5、10、20、30、40 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，進樣量(μg)的常數(shù)對數(shù)值X與色譜峰面積的對數(shù)值Y經線性回歸，得回歸方程：Y柴胡皂苷a=1.243X+9.779，r=0.999 3；Y柴胡皂苷d=1.110X+8.600，r=0.999 0；Y芍藥苷=0.941X+7.641，r=0.999 5；Y阿魏酸=1.437X+11.029，r=0.999 2；Y橙皮苷=0.977X+7.397，r=0.999 2。結果柴胡皂苷a在0.205～1.64 μg，柴胡皂苷d在0.355～2.84 μg，芍藥苷在1.20～9.60 μg，阿魏酸在0.14～1.21 μg，橙皮苷在1.00～8.00 μg線性關系良好。

3.2 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液5 μL，連續(xù)進樣6次，

測定各成分的峰面積，分別計算其RSD值，結果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷峰面積常用對數(shù)的RSD分別為1.6%、2.1%、1.7%、2.6%和2.9%，表明儀器的精密度良好。

3.3 重復性試驗

取柴胡消癭顆粒(批號：20130301)，平行6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，各取5 μL進樣，測定各成分峰面積，計算柴胡消癭顆粒中各待測成分的質量分數(shù)和RSD。結果柴胡皂苷a的質量分數(shù)為0.012 1 mg·g-1，RSD為2.8%；柴胡皂苷d的質量分數(shù)為0.013 8 mg·g-1，RSD為3.1%；芍藥苷的質量分數(shù)為0.250 mg·g-1，RSD為1.0%；阿魏酸的質量分數(shù)為0.017 0 mg·g-1，RSD為1.3%；橙皮苷的質量分數(shù)為0.096 8 mg·g-1，RSD為1.9%，表明本法的重復性良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗

取柴胡消癭顆粒(批號：20130401)，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、6、8 h，各取5 μL進樣，測定各成分峰面積，結果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷峰面積的常用對數(shù)的RSD分別為3.6%、3.1%、1.8%、3.0%、3.1%，表明供試品溶液在室溫條件下放置8 h內基本穩(wěn)定。

3.5 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的柴胡消癭顆粒(批號：20130302)1.0 g，平行6份，分別精密加入柴胡皂苷a對照品溶液0.25 mL(質量濃度為0.041 mg·mL-1)、柴胡皂苷d對照品溶液0.20 mL(質量濃度為0.071 mg·mL-1)、芍藥苷對照品溶液1.00 mL(質量濃度為0.240 mg·mL-1)、阿魏酸對照品溶液0.50 mL(質量濃度為0.028 mg·mL-1)和橙皮苷對照品溶液0.45 mL(質量濃度為0.200 mg·mL-1)，按2.3項下方法操作，進行定量測定，計算回收率，結果表明該方法的準確度良好。見表1。

3.6 樣品測定

按2.3項下供試品溶液制備方法及2.1項下條件，對5批柴胡消癭顆粒進行含量測定，以回歸方程計算各成分質量分數(shù)，結果見表2。

表1 加樣回收試驗結果

表2 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、橙皮苷、阿魏酸的含量(n=5)

4 討論

4.1 檢測器的選擇

復方柴胡消癭顆粒中有效成分芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷在紫外區(qū)有較強的吸收，而柴胡的有效成分柴胡皂a為齊墩果烷型三萜皂苷，分子結構中僅有一個雙鍵，僅有較弱的末端吸收。應用高效液相色譜法測定柴胡皂苷a、d含量的報道較多，檢測波長多在210 nm左右。鑒于在利用紫外末端吸收處進行定量分析檢測靈敏度低，基線容易發(fā)生漂移，嚴重影響含量測定的準確性，故本試驗采用蒸發(fā)光散射檢測器，靈敏度高，基線平穩(wěn)，分離度好，能明顯減少雜質峰的干擾，出峰時間短，便于操作[5]。

4.2 流動相的選擇

柴胡消癭顆粒為復方制劑，方中成分復雜，干擾成分較多。通過文獻查閱[2-4，6-11]，筆者曾分別采用了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸等流動相系統(tǒng)，分別按不同洗脫方法進行洗脫。結果表明，采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸進行梯度洗脫，5種有效成分中芍藥苷、橙皮苷峰拖尾較嚴重，柴胡皂苷不易被洗脫；采用乙腈-醋酸進行梯度洗脫保留時間過長，故筆者選擇以乙腈-0.01%甲酸水梯度洗脫，使各色譜峰有效改善拖尾現(xiàn)象，且能達到較快、較好分離。

4.3 提取方法的選擇

柴胡消癭顆粒中君藥柴胡有效成分柴胡皂苷a含量較低，在酸性條件下，柴胡皂苷a分子結構中的環(huán)氧醚鍵會開環(huán)，轉化為具有共軛雙鍵結構的柴胡皂苷b1，所以使用弱堿性溶劑提取柴胡皂苷a[12]。試驗中分別以甲醇、5%吡啶甲醇、5%氨水甲醇作為提取溶劑，進行超聲提取的方法考察，結果發(fā)現(xiàn)5%氨水甲醇提取效果最佳；考察了不同提取時間(20、30、40 min)樣品中柴胡皂苷a的含量，結果在30～40 min樣品中柴胡皂苷a的含量基本不變；考察了不同溫度下(45、55、65、75、85 ℃)，2 h內柴胡皂苷a含量的變化情況，結果發(fā)現(xiàn)2 h內，在45～55 ℃柴胡皂苷a的含量變化最小[13]。故本試驗選用5%氨水甲醇溶液超聲30 min，50 ℃回收溶劑的提取方法。

4.4本試驗采用HPLC-ELSD同時測定藥材中5種有效成分的含量，方法簡便易行，結果可靠，可為更好地控制該復方制劑提供依據。

4.5由于阿魏酸是弱有機酸，曾有文獻報道其化學穩(wěn)定性不高，水溶液藥物有效期不到2年，見光時分解更快[14]。從測定結果看，不同批次柴胡消癭顆粒樣品中，當歸有效成分阿魏酸的含量差別較大，這是否與該制劑貯藏情況有關，有待于進一步試驗驗證。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 譚雄斯.HPLC-UV-ELSD法測定益肝樂顆粒中槲皮素、山柰素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d[J].中成藥，2014，36(3)：531-535.

[3] 郭春，沈衛(wèi)陽.HPLC-ELSD法同時測定復方柴術片中柴胡皂苷a、芍藥苷與甘草酸的含量[J].中國新藥雜志，2009，18(15)：116-118.

[4] 鐘穎.RP-HPLC-ELSD同時測定復方益母草膠囊中阿魏酸、鹽酸水蘇堿、梓醇、麥角甾苷的含量[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2013，15(6)：106-108.

[5] 王光忠，李秋怡，張蓮萍，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定柴胡藥材中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(10)：1963-1964.

[6] 張宏娜，趙玉英，梁鴻，等.HPLC-ELSD法同時測定柴胡中柴胡皂苷a、c、d、f的含量[J].藥物分析雜，2007，27(8)：1150-1153.

[7] 楊麗娜，溫靜，梁佳佳，等.HPLC-ELSD法同時測定四逆散不同配伍中柴胡皂苷a、b2、c的含量[J].中國藥師，2013，16(9)：1275-1278.

[8] 高穎，高文遠，董玄.HPLC-ELSD法測定血府逐瘀膠囊中苦杏仁苷、芍藥苷和柚皮苷[J].中草藥，2009，40(11)：1756-1758.

[9] 宋宏剛，許紅輝，裴彩云，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定柴胡中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(10)：1963-1964.

[10] 吳麗敏，王愛武，耿暉，等.HPLC-ELSD法測定獨活寄生合劑中芍藥苷的含量[J].中國藥師，2005，8(2)：122-123.

[11] Zhou Y，Wang Y L，Ma Zh Q，et al.Chromatographic fingerprint analysis ofBupleuriRadixby HPLC-ELSD[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2013，22(1)，40-46.

[12] 熊夢曉，黃必勝，白楊，等.RP-HPLC法測定保康北柴胡中柴胡皂苷a、d的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2007，22(2)：42-44.

[13] 趙森銘.HPLC法再研究水煎煮時間對柴胡皂苷成分溶出量的影響[J].北方藥學，2013，10(5)：1-2，60.

[14] 宋浩亮，羅華菲，官洪義.阿魏酸及其制劑的穩(wěn)定性研究[J].安徽醫(yī)藥，2003，7(4)：252-253.

SimultaneousDeterminationofSaikosaponina、Saikosaponind、Paeoniflorin、FerulicAcidandHesperidininChaihuXiaoyingGranulesbyHPLC-ELSD

ZHOUXu，ZHAIYanjun1*

(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian，Liaoning116600，China)

Objective：To establish an HPLC-ELSD method for simultaneous determination of saikosaponin a、saikosaponin d、paeoniflorin、ferulic acid and hesperidin in Chaihu Xiaoying Granules.Methods：The chromatographic separation was performed on Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column.The mobile phase was acetonitrile-0.1% formic acid in gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1and column temperature maintained at 25 ℃.Evaporative light scattering detector was used.The drift tube temperature was 60 ℃.The N2gas flow was 3.0 MPa，Gain 6.Results：The five constituents were separated well.The linear range of saikosaponin a was 0.21-1.64 μg，r=0.999 3，average recovery was 102.2%，RSD 1.5%。The linear range of saikosaponin d was 0.355-2.84 μg，r=0.999 0，average recovery was 101.9%，RSD1.5%。The linear range of paeoniflorin was 1.20-9.60 μg，r=0.999 5，average recovery was 97.93%，RSD2.2%。The linear range of ferulic acid was 0.140-1.12 μg，r=0.999 2，average recovery was 98.79%，RSD2.7%。The linear range of hesperidin was1.00-8.00 μg，r=0.999 2，average recovery was 99.9%，RSD2.6%.Conclusion：The method is rapid，simple and accurate，and can be used for quality control of Chaihu Xiaoying Granules.

Chaihu Xiaoying Granules；saikosaponin a；saikosaponin d；paeoniflorin；ferulic acid；hesperidin；HPLC-ELSD

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.009

2014-10-27)

*

翟延君，博士，教授，研究方向：中藥質量評價；E-mail:lnzyzj@sohu.com