疏風解毒膠囊腸吸收液對LPS誘導巨噬細胞釋放細胞因子的影響△

何子龍，方文娟，張方博，楊洪軍，劉釗，楊鴻*

(1.江西中醫(yī)藥大學 藥學院，江西 南昌 330004；2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700；3.中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心，北京 100700)

·基礎研究·

疏風解毒膠囊腸吸收液對LPS誘導巨噬細胞釋放細胞因子的影響△

何子龍1，2，方文娟1，張方博2*，楊洪軍2，劉釗3，楊鴻3*

(1.江西中醫(yī)藥大學 藥學院，江西 南昌 330004；2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700；3.中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心，北京 100700)

目的：研究疏風解毒膠囊腸吸收液對LPS誘導巨噬細胞釋放細胞因子的影響。方法：采用外翻腸囊法制備不同濃度的疏風解毒膠囊腸吸收液，1 μg·mL-1脂多糖(LPS)誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7制備炎癥模型，液相蛋白芯片技術檢測細胞因子在正常組、模型組、給藥組表達的具體水平。結果：含疏風解毒膠囊腸吸收液能降低IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、KC、TNF-α13種細胞因子的表達水平，且與雷公藤內酯醇組效果相當。結論：疏風解毒膠囊抗炎作用的機制與抑制上述炎癥因子的釋放有關。

疏風解毒膠囊；腸吸收液；細胞因子；抗炎

炎癥反應開始于炎癥細胞的黏附、遷徙、浸潤、活化及炎癥因子的釋放，這些炎癥細胞產物之間相互促進，并與細胞內各種轉錄因子相互聯(lián)系，使早期炎癥反應放大和持續(xù)。脂多糖(LPS)侵入機體后可以激活單核巨噬細胞，誘導其釋放大量的促炎因子和介質，如白介素類IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1等，調節(jié)這些炎癥分子的生成是治療各種與炎癥相關疾病的重要靶點。

液相蛋白芯片由于高通量、自動化、快速、敏感以及多元化等特點，可檢測多種細胞信號分子的表達水平，適用于細胞因子表達的系統(tǒng)研究[1]。中藥多為口服制劑，經過消化道和腸道菌群，被直接排泄或選擇性吸收，只有被吸收的藥物才能在體內發(fā)揮作用。腸囊外翻(VEIS)技術作為一種成熟穩(wěn)定的體外腸吸收模型，已經被廣泛用于藥物的吸收、代謝等研究中[2]。與血清藥理學相比，腸吸收液的成分多、含藥量較高、干擾性成分少、活性顯著。

疏風解毒膠囊是由虎杖、連翹、板藍根、柴胡、敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草等組成的中藥復方制劑，具有疏風清熱，解毒利咽之功能，用于治療急性上呼吸道感染(屬風熱證)。其對傷寒桿菌內毒素引起的大鼠發(fā)熱反應、炎癥早期的滲出水腫(耳廓腫)有明顯抑制作用。疏風解毒膠囊對流感病毒感染的預防具有保護作用[5]。疏風解毒膠囊可抑制LPS誘導的炎性反應，可減輕內毒素導致的肺損傷反應[6]。

本研究利用LPS誘導巨噬細胞RAW264.7炎癥細胞模型，應用液相蛋白芯片技術，通過測定疏風解毒膠囊腸吸收液對該模型細胞因子表達譜的影響，對其抗炎作用機制進行系統(tǒng)全面地研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Bio-Plex 200懸液芯片系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；電子分析天平(BP110S型，Sartorius 公司)；旋轉蒸發(fā)器(EYELA SB-1100型，EYELA公司)；循環(huán)水真空泵(SHZ-DⅢ型，鞏義市予華儀器有限責任公司)；超聲清洗器(KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；組織-器官水浴系統(tǒng)(ALC-M型，上海奧爾科特生物科技有限公司)；超級潔凈工作臺(SCB-1360型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-18AIC型，三洋電機株式會社)。

1.2 材料

大腸桿菌脂多糖(LPS)(L2630，美國sigma公司)；雷公藤內酯醇(中國食品藥品檢定研究院)；疏風解毒膠囊(安徽濟人藥業(yè)有限公司，批號：140902)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號：140527)；DMEM高糖細胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：8113138)；HyClone雙抗Penicillin-Streptomycin(美國Thermo公司，批號：J130071)；胰酶(北京賽馳生物科技有限公司，批號：140622)。

清潔級SD大鼠，雄性，體重(240±20)g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，合格證號：SCXK(京)2009-0017。

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自中國醫(yī)學科學院基礎研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院細胞中心。

2 方法

2.1 藥品配制

雷公藤內酯醇、LPS分別溶于高糖DMEM培養(yǎng)液中，參考黃斌等[3]利用腸囊外翻法制備疏風解毒膠囊腸吸收液的方法，實驗前大鼠禁食12 h，脫臼處死，剪開腹腔，依次迅速取出4段相應腸段，腸囊外翻后，結扎加入臺式液，在組織-器官水浴系統(tǒng)中加入疏風解毒膠囊供試液，通入95%O2、5%CO2的混合空氣，37 ℃恒溫2 h后，合并腸吸收液。溶液用0.22 μm過濾器過濾，分裝保存于1.5 mL錐形離心管中，-20 ℃保存，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·mL-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液。

2.3 細胞分組及處理

實驗分為正常對照組(空白腸吸收液)、模型組(1 μg·mL-1LPS)、雷公藤內酯醇組(0.006 4 μg·mL-1)、疏風解毒膠囊腸吸收液不同劑量組(劑量分別為62.5、31.25、15.625、7.812 5、3.906 3 μg·mL-1)。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的RAW264.7細胞進行實驗，棄去原培養(yǎng)液，加入適量高糖DMEM培養(yǎng)液，反復吹打制成1×105個/mL的單細胞懸液。24孔細胞板，每孔接種1 mL細胞懸液，培養(yǎng)24 h后依照實驗分組，加入不同濃度的疏風解毒膠囊腸吸收液和雷公藤內酯醇，孵育4 h后加入LPS(1 μg·mL-1)進行刺激。20 h后收集各組細胞培養(yǎng)上清液，凍存于-80 ℃超低溫冰箱，備用。

2.4Bio-PLex 200液相蛋白芯片分析系統(tǒng)檢測細胞因子

取待檢測細胞上清液樣品，室溫溶解后，10 000 r·min-1高速冷凍離心10 min，上清液用緩沖液稀釋(1∶10)。依據試劑盒說明，在96孔磁珠板上標記空白對照、標準曲線和待測樣品標號。每孔加入50 μL偶聯(lián)有抗細胞因子抗體的檢測磁珠，洗滌2次。向相應孔板加入50 μL Bio-plex緩沖液、標準曲線樣品溶液、待檢測細胞上清液樣品，室溫避光，500 r·min-1搖床上孵育30 min，洗滌3次。依次分別加入50 μL檢測抗體和50 μLSteptavidin-PE熒光色素，每孔加入125 μL緩沖液重懸微珠，放入Bio-plex-200液相芯片檢測系統(tǒng)，讀取各孔熒光強度，并根據標準品的熒光強度計算出樣品中白介素類因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、小鼠角化細胞性細胞因子(KC)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)共14種細胞因子濃度。

2.5 數(shù)據處理

3 結果

在正常RAW264.7細胞中，各種細胞因子均有較低表達，經LPS刺激后，RAW264.7細胞表達大量的細胞因子。結果顯示，LPS模型組與對照組相比，IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、MCP-1、G-CSF、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、KC細胞因子表達水平極顯著升高(P<0.01)，IL-2細胞因子表達水平顯著升高(P<0.05)；雷公藤內酯醇對IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、GM-CSF、IFN-γ、KC、MCP-1、TNF-α的表達水平有明顯的下調作用(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1 疏風解毒膠囊腸吸收液對LPS誘導RAW264.7細胞表達各種細胞因子的影響

注：與對照組比較1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較3)P<0.01，4)P<0.05。

4 討論

液相蛋白芯片技術被喻為后基因組時代的新型芯片技術，可用于蛋白質和核酸等生物分子的高通量檢測平臺。其同步性好、通量大、準確性高等特性能很好地突破傳統(tǒng)中藥研究中單個散在指標的局限性，節(jié)約珍貴樣本，提高中藥研究結果的準確性和可靠性，比較全面系統(tǒng)地闡明中藥多靶點的作用機制。外翻腸囊保留了完整的組織和黏膜特性，可模擬體內生理狀態(tài)下不同腸段對藥物的吸收情況[4]，與提取物比較腸吸收液的實驗結果與體內實驗一致；與血清藥理學比較，腸吸收液排除了內源性物質的干擾，且藥效顯著，適用于口服制劑藥物的研究。

疏風解毒膠囊對于炎性反應的抑制機制可能與抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、轉錄因子(NF-κB)通路，下調NF-κBmRNA的表達有關[7]。疏風解毒膠囊腸吸收液通過抑制IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4的表達，可抑制傳遞抗原的細胞(APC)和T細胞活化，減弱B細胞增殖和抗體分泌，抑制其他細胞因子產生和急性期蛋白的合成來降低炎癥反應；同時，抑制IL-10、IL-12(p70)、IL-13誘導的單核細胞分化，調控單核細胞因子分泌，控制炎癥反應；降低粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的表達，減少粒細胞和巨噬細胞集落；抑制IFN-γ誘導巨噬細胞一氧化氮合酶(iNOS)的產生，從而減少NO的合成；有效抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介質的分泌和釋放，阻止了炎癥的擴大化和級聯(lián)反應。其中IL-17是T細胞誘導炎癥反應的早期啟動因子，可通過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應，激活和刺激T細胞、上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生的IL-6、IL-8、GM-CSF和細胞黏附分子-1(CAM-1)等，從而導致炎癥的產生。疏風解毒膠囊腸吸收液可能通過抑制IL-17的表達，降低細胞因子的產生，抑制中性粒細胞的活化，減輕炎癥反應。

本研究顯示，疏風解毒膠囊制備的腸吸收液能通過有效抑制多種細胞因子的釋放，發(fā)揮多靶點抗炎效果，減輕系統(tǒng)性炎癥反應，起到顯著的抗炎作用。因此，應用外翻腸囊法，結合蛋白芯片研究技術可以對中藥復方及其成分藥效、分子機制進行系統(tǒng)準確地分析研究。

[1] 楊鴻，劉釗，鐘菊迎，等.基于液相蛋白芯片的甘草有效成分抑制巨噬細胞細胞因子譜表達的研究[J].中國中藥雜志，2014，39(19)，3841-3844.

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[4] Patel J P，Korashy H M，El-KadiAO，etal.Effect of bileand lipids on the stereoselective metabolism of halofantrine by rat everted-intestinal sacs[J].Chirality，2010，22(2)：275.

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EffectofIntestinalAbsorptionLiquidContainingBreezeDetoxificationCapsuleonLPS-inducedCytokinesReactioninMacrophage

HEZilong1，2，F(xiàn)ANGWenjuan1，ZHANGFangbo2*，YANGHongjun2，LIUZhao3，YANGHong3*

(1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicinecollegeofpharmacy，Jangxi，NanChang330004，China；2.InstituteofChineseMateriaMedicaChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；3.ExperimentalResearchCenterChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To study the effect of the intestinal absorption liquid containing Breeze Detoxification Capsule(BDC)on LPS-induced cytokines expression in macrophage.Methods：The liquid protein chip was applied to detect the influence of BDC intestinal absorption liquid on cytokines released by LPS-induced macrophage RAW264.7 based on mice inflammation model.Result：The BDC intestine absorption liquid reduced the cytokine expression level of IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-10，IL-12(p70)，IL-13，IL-17，G-CSF，GM-CSF，IFN-γ，KC，TNF-α，totally 13 kinds，which had similar effects with triptonide group.Conclusion：The anti-inflammatory mechanism of BDC might be related to inhibition of inflammatory cytokine release.

Breeze detoxification capsules；intestinal absorption liquid；Cytokines；anti-inflammatory

2015-01-13)

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(200907001-5)

*

張方博，博士，研究方向：藥理學研究；E-mail：zhangfangbo68@163.com 楊鴻，博士，副研究員，研究方向：中醫(yī)證侯系統(tǒng)生物學及中藥復方配伍的分子機制研究；Tel：(010)64014411-3327，E-mail：leslie18029@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.012