芪龍益腎湯對糖尿病腎病大鼠血清Cys-c、HbAlc及umAlb水平的影響△

李委兄，許筠，翟曉麗，丁夏楠，李桂霞

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

·基礎(chǔ)研究·

芪龍益腎湯對糖尿病腎病大鼠血清Cys-c、HbAlc及umAlb水平的影響△

李委兄1，許筠2*，翟曉麗2，丁夏楠1，李桂霞1

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

目的：觀察芪龍益腎湯對糖尿病腎病大鼠的治療作用。方法：將60只SPF級Wistar雄性大鼠稱重，隨機(jī)選10只為正常對照組，以普通飼料喂養(yǎng)。剩余大鼠以高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，空腹12 h，給予小劑量鏈脲佐菌素(劑量為30 mg·kg-1)，腹腔注射，連續(xù)注射3 d。大鼠造模后稱重，再隨機(jī)將造模成功大鼠分為模型組、芪龍益腎湯高、中、低劑量組(劑量分別為每天25.2、12.6、6.3 g·kg-1)、厄貝沙坦組，每組9只。給藥干預(yù)治療8周后，將各組大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿量，測定尿微量白蛋白(umAlb)。麻醉取血，分離血清，測定胱抑素C(Cys-c)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、空腹血糖(FPG)水平。結(jié)果：給藥8周后，與正常對照組比較，模型組大鼠血清Cys-c、HbAlc、FPG及umAlb水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，芪龍益腎湯中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠血清Cys-c、HbAlc、FPG及umAlb水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：芪龍益腎湯能降低早期糖尿病腎病大鼠的血清Cys-c、HbAlc、FPG及umAlb表達(dá)水平，改善腎功能。

糖尿病腎??；芪龍益腎湯；胱抑素C；糖化血紅蛋白；尿微量白蛋白

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，其病理改變主要是毛細(xì)血管基底膜增厚及系膜基質(zhì)增生，最終導(dǎo)致腎小球硬化。目前，糖尿病腎病在歐美位居終末期腎病的首位[1]，在我國也上升至終末期腎病的第2位，約占總終末期腎病的25%[2]，而且目前仍然有上升的趨勢。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，胱抑素C(Cys-c)、糖化血紅蛋白(HbAlc)及尿微量白蛋白(umAlb)水平可以作為診斷早期DN的重要指標(biāo)，聯(lián)合檢測三者對早期DN的診斷具有重要意義[3]。早期DN可歸屬中醫(yī)學(xué)“消渴”的范疇，其臨床表現(xiàn)以氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)為多見[4]。中藥復(fù)方芪龍益腎湯是翟曉麗主任醫(yī)師在蘭州大學(xué)第二人民醫(yī)院劉寶厚教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上總結(jié)而來的方藥，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之功能，在臨床上己使用多年，取得了良好的療效。本研究采用鏈脲佐菌素注射造成大鼠DN動(dòng)物模型，旨在通過觀察芪龍益腎湯對DN大鼠Cys-c、HbAlc及umAlb等指標(biāo)的影響，來進(jìn)一步證實(shí)中藥復(fù)方芪龍益腎湯可以起到保護(hù)糖尿病患者腎臟的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：SPF級Wistar雄性大鼠60只，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供，體重為(200±20) g/只，動(dòng)物使用許可證號為SCXK(甘)2011-0001。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意。

芪龍益腎湯處方由生黃芪30 g、生地黃10 g、干地龍10 g、太子參15 g、玄參15 g、丹皮10 g、丹參10 g、天花粉15 g、茯苓15 g、甘草10 g組成，加1000 mL水，浸泡30 min，煮沸30 min，過濾取汁；再加1000 mL水，煮沸30 min，過濾取汁，合并2次藥液。水浴濃縮成每1 mL含2 g生藥的藥液，高壓滅菌，置4 ℃冰箱保存，備用(原生藥由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥房提供)；厄貝沙坦片[賽諾菲(杭州)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 H20040494]；鏈脲佐菌素(STZ，美國 SIGMA)；大鼠代謝籠(意大利Tecniplast)；大鼠胱抑素-C測定試劑盒(美國R&D公司)；大鼠微量白蛋白測定試劑盒(美國Bethyl公司)；糖化血紅蛋白測定試劑盒(美國Helena)；ACCU-CHEK血糖儀(德國羅氏)。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模 將60只大鼠稱重，隨機(jī)選10只為正常對照組，以普通飼料喂養(yǎng)。剩余大鼠以高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后造模，稱重(除去死亡等不合格大鼠5只)，再隨機(jī)將造模大鼠分為模型組、芪龍益腎湯高、中、低劑量組(劑量分別為每天25.2、12.6、6.3 g·kg-1)、厄貝沙坦組，每組9只。

模型組及其他各治療組大鼠空腹12 h后給予小劑量鏈脲佐菌素(30 mg·kg-1，溶入PH為4.5的0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液中)，腹腔注射，連續(xù)注射3 d。造模完成72 h后，經(jīng)尾靜脈采血測血糖。測隨機(jī)血糖，血糖值≥16.7 mmol·L-1為Ⅱ型糖尿??；血糖值≥1次未達(dá)標(biāo)者測空腹血糖FPG和葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)2 h血糖(實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，空腹尾尖取血，測FPG，繼以2 g·kg-1葡萄糖灌胃，于120 min時(shí)取血測血糖)，F(xiàn)PG≥7.0 mmol·L-1和(或)2 h PG≥11.1 mmol·L-1者亦為Ⅱ型糖尿病大鼠。在STZ注射3周后，檢測大鼠尿蛋白排泄率，若持續(xù)增加，則確定糖尿病腎病造模成功[5]。造模結(jié)束后，正常對照組剩余10只大鼠，模型組剩余8只大鼠，芪龍益腎湯高劑量組剩余8只大鼠，中劑量組剩余8只大鼠，低劑量組剩余7只大鼠，厄貝沙坦組剩余9只大鼠。各組大鼠數(shù)量減少的原因主要為造模技術(shù)不熟練或造模不成功等。

1.2.2 給藥 各治療組處方量均按照《中藥藥理研究方法學(xué)》中，人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體表面積折算等效劑量比換算。芪龍益腎湯各組大鼠分別按相應(yīng)劑量灌胃給藥；厄貝沙坦組每天按12.6 mg·kg-1劑量灌胃；正常對照組、模型組大鼠每天灌胃等容量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)治療8周。治療結(jié)束后，正常對照組剩余10只大鼠，模型組剩余6只大鼠，芪龍益腎湯高劑量組剩余7只大鼠，中劑量組剩余8只大鼠，低劑量組剩余6只大鼠，厄貝沙坦組剩余8只大鼠。此次大鼠數(shù)量減少的原因主要為高血糖引起的代謝紊亂，導(dǎo)致臟器衰竭等。

1.2.3 檢測指標(biāo) 造模3周后，各組大鼠尾尖取血，同時(shí)留取24 h尿，對指標(biāo)進(jìn)行檢測；給藥8周后留取24 h尿，行股動(dòng)脈取血，并處死大鼠，對指標(biāo)進(jìn)行檢測。血清胱抑素C 和umAlb采用 ELISA法，HbAlc采用親和色譜微柱法，F(xiàn)PG采用羅氏血糖儀進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 芪龍益腎湯對糖尿病腎病大鼠一般情況的影響

造模后大鼠與正常對照組相比逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食、體重減輕、毛發(fā)枯黃無光澤等癥狀。各治療組給藥8周后與模型組比較，大鼠精神狀態(tài)好、豎毛較少、活動(dòng)較好。

2.2芪龍益腎湯對DN大鼠血清Cys-c及umAlb水平的影響

給藥8周后，與正常對照組比較，模型組大鼠血清Cys-c及umAlb水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組大鼠比較，芪龍益腎湯低、中、高劑量組大鼠血清Cys-c及umAlb水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而芪龍益腎湯中、高劑量組及厄貝沙坦組血清Cys-c及umAlb水平降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與造模3周后比較，給藥8周后芪龍益腎湯中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠血清Cys-c及umAlb水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清CysC、umAlb水平的比較

注:與正常對照組比較,aP<0.01；與模型組比較,bP<0.05，cP<0.05，dP<0.05；與芪龍益腎湯低劑量比較，bP<0.05；與治療前比較，bP<0.05，cP<0.05，dP<0.05。

2.3芪龍益腎湯對糖尿病腎病大鼠FPG、HbAlc水平的影響

給藥8周后，與正常對照組比較，模型組大鼠FPG、HbAlc明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對照組大鼠比較，芪龍益腎湯中、低劑量組大鼠FPG、HbAlc明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，芪龍益腎湯高劑量組與厄貝沙坦組降低大鼠FPG、HbAlc作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清FPG、HbAlc水平的比較

注：與正常對照組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05，cP<0.05；與厄貝沙坦組比較，bP<0.05；與芪龍益腎湯低劑量比較，bP<0.05；與治療前比，bP<0.05，cP<0.05。

3 討論

Cys-c是一種分泌性低分子蛋白，由于其產(chǎn)生速率恒定，幾乎全部由腎小球?yàn)V過，是測定腎小球?yàn)V過功能較理想的檢測指標(biāo)[6]。Cys-c也是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，存在于所有細(xì)胞核中，生成速度恒定，血濃度穩(wěn)定，不易受其他炎癥、免疫等因素的影響，且腎臟是其唯一的代謝及濾過的器官。Cys-c是一種反映腎小球?yàn)V過率的理想指標(biāo)，不僅可以作為早期腎臟損害的標(biāo)志，而且可作為腎功能監(jiān)測的標(biāo)志[7]。umAlb屬于腎小球性蛋白，是腎小球篩網(wǎng)選擇性和電荷選擇性屏障損傷的主要標(biāo)志性蛋白，是判斷腎小球受損程度的重要標(biāo)志物，Ⅱ型糖尿病(T2DM)血糖控制不佳者，由于長期高血糖使腎小球基底膜增厚，腎小球處于高濾過狀態(tài)，基底膜通透性增高，從而引起腎損害，最終導(dǎo)致大量umAlb在尿中排出。umAlb檢測是目前臨床用來監(jiān)測T2DM早期腎損害的常規(guī)指標(biāo)[8]。HbAlc量與血糖濃度呈正相關(guān)，其值反映患者體內(nèi)取血前8～12周血糖總水平，通常約為3%～6%[9]。高血糖狀態(tài)下 HbAlc生成變多，與氧合血紅蛋白競爭攜氧能力，加上高糖狀態(tài)使血液黏稠度升高，導(dǎo)致微血管灌流不足、組織細(xì)胞缺氧，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，基底膜電荷屏障缺損，出現(xiàn)蛋白尿[10]。HbAlc代表患者體內(nèi)的血糖水平，與糖尿病患者腎功能損害有相關(guān)性，其可作為判斷有無腎功能損害及損害程度的指標(biāo)[11]。目前Cys-c、HbAlc及umAlb作為診斷早期DN的重要指標(biāo)，聯(lián)合檢測三者及FPG對中藥復(fù)方芪龍益腎湯治療DN大鼠也具有重要意義。

本研究用的中藥復(fù)方芪龍益腎湯主要由生黃芪、生地黃、干地龍、太子參、玄參、丹皮、丹參、天花粉、茯苓等組成。方中生黃芪、太子參益氣健脾，有復(fù)升清降濁之功；生地黃、玄參、山萸肉滋養(yǎng)陰精；天花粉、丹皮以助生地黃等養(yǎng)陰清熱，防陰虛火旺；丹參、干地龍活血化瘀，通利瘀滯之脈管。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之功。

本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方芪龍益腎湯高、中劑量組及厄貝沙坦組均能顯著減少DN模型大鼠Cys-c、FPG、HbAlc及umAlb水平，且高劑量組與厄貝沙坦組療效類似，證實(shí)了中藥復(fù)方芪龍益腎湯可以起到保護(hù)糖尿病患者腎臟的作用，其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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EffectofQilongyishenTangonLevelofSerumCys-c，HbAlcandumAlbinKidneyofRatswithDiabeticNephropathy

LIWeixiong1，XUJun2*，ZHAIXiaoli2，DINGXianan1，LIGuixia1

(1.GansuunivercityoftraditionalChinesemedicine,730000,China；2.Thesecondpeople’shospitaloflanzhoucity，730000，china)

Objective：To observe the therapautic effects of Qilongyishen tang on rats with nephropathy(DN).Methods：60 Wistar SPF rats were weighed，10 rats were randomly selected as normal control group and fed them with ordinary diet.While the other rats were fed with high fat diet for 8 weeks then injected with streptozotocin(STZ)in lower dose of 30 mg/kg for three days after fasting for 12 hours.When the diabetic nephropathy model was establishied，rats were weighed and divided randomly into model group，group treated with Irbesantan and groups treated with traditional Chinese medicine in low，medium and high dose.Each group had 9 rats.All rats were placed in metabolic cages and observed the general vital energy，urinary production and 24-hour urine preotein after consecutive 8 weeks intervention.The rats were then anesthetized and blood samples were collected.Finally，the serum was separated and the level of Cys-c and HbAlc was determined.Result：The level of Cys-c，HbAlc，F(xiàn)PG and umAlb in the model group were singnificantly higher than that in the normal group(P<0.05)，which were in the treatment with traditional Chinese medicine in medium and high dose and Irbesantan group were significantly lower than those that were in the model group(P<0.05).Conclusion：Qilongyishen tang can reduce the level of early diabetic nephropathy rats’ serum Cys-c，HbAlc，F(xiàn)PG and umAlb.

Diabetic nephropathy；Qilongyishen tang；Cys-c；HbAlc；umAlb

2015-01-15)

甘肅省中醫(yī)藥管理局基金資助項(xiàng)目(GZK-2012-63)

*

許筠，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病腎病; E-mail:38845597@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.011