陶瓷膜過(guò)濾在分離提取中國(guó)林蛙皮中透明質(zhì)酸的應(yīng)用研究△

鮑悅，孫尚志，孫佳明，張輝*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.拜泰齊貿(mào)易(上海)有限公司，上海 201203)

·中藥工業(yè)·

陶瓷膜過(guò)濾在分離提取中國(guó)林蛙皮中透明質(zhì)酸的應(yīng)用研究△

鮑悅1，孫尚志2，孫佳明1，張輝1*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.拜泰齊貿(mào)易(上海)有限公司，上海 201203)

目的：研究陶瓷膜過(guò)濾技術(shù)對(duì)中國(guó)林蛙皮中透明質(zhì)酸(HA)的純化工藝。方法：以膜通量或截留率為指標(biāo)，運(yùn)用單因素試驗(yàn)優(yōu)選中國(guó)林蛙皮中HA的陶瓷膜純化工藝參數(shù)。結(jié)果：陶瓷膜最佳的分離純化條件為孔徑500 nm，操作壓力0.1 MPa，濾過(guò)25 min，HA截留率91.67%；HA中葡萄糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.68%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.58%，該純度已達(dá)到化妝品級(jí)別。結(jié)論：該陶瓷膜過(guò)濾工藝適用于純化中國(guó)林蛙皮中的HA，對(duì)中國(guó)林蛙的產(chǎn)業(yè)化起到一定的促進(jìn)作用。

陶瓷膜過(guò)濾；中國(guó)林蛙皮；透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸(HA)是一種高分子量的直鏈多糖，早在1934年Meyer和Palmer[1]首次從牛眼的玻璃體組織中分離出玻璃酸及其鈉鹽，命名為HA。HA是一種重要的醫(yī)藥用原料，同時(shí)也是理想的保濕劑和良好的透皮吸收促進(jìn)劑，并且還是理想的天然保濕因子。二十幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其理化性質(zhì)，生理功能以及應(yīng)用[2-12]進(jìn)行了較為全面，系統(tǒng)的研究。

在前人對(duì)HA以及陶瓷膜過(guò)濾技術(shù)的研究[13-16]基礎(chǔ)上，改進(jìn)HA的陶瓷膜過(guò)濾工藝，以陶瓷膜過(guò)濾方法替代了傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑法來(lái)去除中國(guó)林蛙皮提取物中的蛋白。吉林省的中國(guó)林蛙資源較為豐富，將優(yōu)化后的膜分離工藝應(yīng)用于中國(guó)林蛙皮中HA的分離純化，使其純度達(dá)到化妝品級(jí)別，能為林蛙整個(gè)行業(yè)的發(fā)展帶來(lái)較為可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

1 儀器與材料

1.1 儀器

低速大容量多管離心機(jī)，低溫超速離心機(jī)，KQ-100型超聲波清洗器，陶瓷膜過(guò)濾設(shè)備，DZF-6050型真空干燥箱，PHS-2C型精密酸度計(jì)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Cary 50 UV-Vis)等。

1.2 材料

胃蛋白酶(1∶3000)(中國(guó)惠世化學(xué)試劑有限公司)，三氯醋酸(沈陽(yáng)市新西試劑廠)，高嶺土(廣東省汕頭市西隴化工廠)，氯化鈉、95%乙醇、無(wú)水乙醇(北京化工廠)，鹽酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

中國(guó)林蛙皮，源自吉林省輝南縣的野生健康林蛙，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為林蛙Ranatemporariachensinensis的皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 HA的提取

選擇取油后的中國(guó)林蛙皮，粉碎，加10倍量水浸泡24 h，以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速勻漿3 min，勻漿后成糊狀，攪拌加熱至90 ℃，保溫10 min，冷卻至50 ℃，自溶12 h，4000 r·min-1離心除去殘?jiān)?，殘?jiān)?倍量水洗滌兩次，得HA粗提取液。

2.2 HA的陶瓷膜過(guò)濾

2.2.1 截留率的測(cè)定 精密稱取葡糖醛酸(AR)20 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻備用。按照葡糖醛酸含量測(cè)定方法，在530 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度作圖，繪制葡糖醛酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.012X-0.002 7，r=0.999 2。

取上述HA粗提取液4000 mL，在操作壓力為0.1 MPa，以孔徑500 nm、比表面積0.5 m2進(jìn)行濾過(guò)25 min。取濾過(guò)前的原液和截留液按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行葡糖醛酸含量的測(cè)定，得出相應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為C1和C2，按公式計(jì)算得出相應(yīng)的截留率。

截留率(%)=(1-C2/C1)×100%

(1)

2.2.2 膜孔徑的確定 取上述HA粗提取液4000 mL，用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0，在操作壓力為0.1 MPa，以孔徑500 nm和孔徑100 nm兩種規(guī)格的陶瓷膜，比表面積0.5 m2分別進(jìn)行濾過(guò)25 min，按照上述截留率的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，以陶瓷膜對(duì)HA的截留率為考察指標(biāo)，考察兩種規(guī)格的陶瓷膜在截留HA的差異，結(jié)果截留率分別為91.67%、93.85%。

2.2.3 操作壓力對(duì)膜通量的影響 取上述HA粗提取液4000 mL，用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0，以孔徑500 nm、比表面積0.5 m2進(jìn)行濾過(guò)25 min，考察陶瓷膜工作過(guò)程中膜通量(mL·cm-2·h-1)隨壓力的變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 操作壓力對(duì)中國(guó)林蛙HA膜通量的影響

2.2.4 膜通量隨時(shí)間的變化 取上述HA粗提取液4000 mL，用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0，在操作壓力為0.1 MPa，以孔徑500 nm、比表面積0.5 m2進(jìn)行濾過(guò)，考察陶瓷膜工作過(guò)程中膜通量(mL·cm-2·h-1)隨時(shí)間的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)中國(guó)林蛙膜通量的影響

2.2.5 HA的陶瓷膜過(guò)濾最佳工藝 取上述HA粗提取液4000 mL，用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0，在0.1 MPa陶瓷膜操作壓力下，以孔徑500 nm、比表面積0.5 m2進(jìn)行濾過(guò)25 min，截留液干燥得HA精制品。

2.3 HA的純化

對(duì)上述經(jīng)過(guò)陶瓷膜過(guò)濾得到的HA精制品進(jìn)一步純化，按照1∶30的比例加入水，同時(shí)加入溶液體積3%的高嶺土50 ℃加熱30 min，離心，少許水洗滌殘?jiān)x心，水液合并，放冷至0～4 ℃，加入三氯醋酸飽和溶液，使溶液中三氯醋酸濃度達(dá)到8%，靜置30 min后，離心，取上清液加入氯化鈉使溶液中氯化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.93%，加入3倍量的95%乙醇，靜置24 h，抽濾，依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇洗滌產(chǎn)品，重復(fù)醇沉1次，得到HA純品[17]。

2.4 HA的純度測(cè)定

2.4.1 HA中葡糖醛酸含量測(cè)定 目前國(guó)內(nèi)外一般以葡糖醛酸含量表示HA的純度，根據(jù)HA的結(jié)構(gòu)計(jì)算，每100 mg透明質(zhì)酸鈉純品完全水解后可產(chǎn)生葡萄糖醛酸48.38 mg、氨基葡萄糖44.65 mg[18]。精密稱取HA純品100 mg置100 mL的容量瓶中，加雙蒸水定容，取該溶液1 mL，按照2.2.1項(xiàng)下的方法測(cè)定，經(jīng)計(jì)算得樣品中的葡萄糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.68%。

2.4.2 HA中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 精密稱取牛血清蛋白(BSA)25 mg，置于100 mL量瓶中，用0.15 mo1·L-1氯化鈉溶液定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg· mL-1的蛋白溶液[19]。按照考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法，以BSA微克數(shù)對(duì)吸光度作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.001 8X+0.010 5，r=0.992 9。精密稱取HA純品500 mg，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行測(cè)定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)的質(zhì)量，以此計(jì)算HA純品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.58%。

3 討論

孔徑500 nm截留分子量100萬(wàn)道爾頓和孔徑100 nm截留分子量30萬(wàn)道爾頓這兩種規(guī)格的陶瓷膜，在HA的截留率上沒(méi)有較大的差別，基于盡量除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的同時(shí)減少耗能的原則，所以選擇孔徑500 nm的陶瓷膜；陶瓷膜在一定壓力范圍內(nèi)，膜通量與壓力差呈正比，但隨著壓力差增大到一定程度，膜通量反而有減小的趨勢(shì)。壓力應(yīng)控制在0.1～0.15 MPa較為適宜，由于壓力在0.1 MPa的時(shí)候，膜通量基本達(dá)到峰值，壓力為0.15 MPa時(shí)的膜通量較壓力為0.1 MPa時(shí)的膜通量并沒(méi)有較大的增長(zhǎng)，并且同時(shí)增加了設(shè)備的負(fù)荷和耗能，故壓力選擇0.1 MPa；HA通過(guò)陶瓷膜的膜通量隨時(shí)間延長(zhǎng)而衰減，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，膜通量基本保持不變。從膜在單位壓力下的自來(lái)水通量(5.7 mL·cm-2·h-1)與過(guò)濾25 min時(shí)的膜通量(2.23 mL·cm-2·h-1)相比，可知膜通量在25 min左右降低了60%左右，因此濾過(guò)時(shí)間確定為25 min。

在應(yīng)用陶瓷膜濾過(guò)分離HA時(shí)，當(dāng)pH調(diào)到1.7～3.3時(shí)，HA易發(fā)生可逆的交聯(lián)反應(yīng)，增大了分子直徑，可以有效提高HA的截留率，因此采用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用于化妝品級(jí)別的HA的平均分子量在300萬(wàn)道爾頓左右[20]，在應(yīng)用陶瓷膜過(guò)濾工藝時(shí)，大部分蛋白質(zhì)可以透過(guò)陶瓷膜，但仍有一部分蛋白質(zhì)因其分子量大于100萬(wàn)道爾頓而與HA一同被截留下來(lái)，故采用三氯醋酸對(duì)陶瓷膜濾過(guò)得到的HA精制品進(jìn)行進(jìn)一步的純化，提高其純度。

將優(yōu)化后陶瓷膜分離工藝應(yīng)用于中國(guó)林蛙皮中HA的分離，使得每千克林蛙皮可收到2.8 g HA純品，對(duì)其中HA進(jìn)行含量測(cè)定，其葡萄糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.68%。由于化妝品級(jí)HA含葡萄糖醛酸為35%～45%，醫(yī)藥級(jí)HA含葡萄糖醛酸量為42%～48%，因此應(yīng)用陶瓷膜過(guò)濾純化得到的中國(guó)林蛙皮HA已達(dá)到化妝品級(jí)別。另經(jīng)測(cè)定純化后的HA中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.58%，可知其中的蛋白質(zhì)含量很低，故陶瓷膜過(guò)濾在分離提取中國(guó)林蛙皮中HA有著較好的效果。陶瓷膜過(guò)濾分離技術(shù)將對(duì)中國(guó)林蛙皮中HA的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)起到一定的促進(jìn)作用。

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ApplicationofCeramicMembraneFiltrationinExtractionofHyaluronicAcidfromSkinofRanatemporariachensinensis

BAOYue1，SUNShangzhi2，SUNJiaming1，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，TraditionalChinesemedicineandbiologicalengineeringresearchanddevelopmentcenter，Changchun130117，China；2.BiotageTrading(Shanghai)Co.，Ltd.，Shanghai201203，China)

Objective：To purify hyaluronic acid (HA) from the skin ofRanatemporariachensinensisby ceramic membrane filtration.Methods：Using membrane flux or rejection as the index，the purification process parameters of HA in the skin was optimized by single factor experiments.Results：Best of ceramic membrane separation and purification conditions：pore size of 500 nm，operating pressure of 0.1 MPa，filtration 25 min，HA retention rate of 91.67%.Glucuronic acid in HA content of 36.68%，0.58% protein content，the purity has reached the cosmetic grade.Conclusion：The ceramic membrane filtration process is suitable for the purification of HA in the skin of Chinese forest frog，it can promote the industrial utilization ofR.temporariachensinensis.

Ceramic membrane filtration；the skin ofRanatemporariachensinensis；hyaluronic acid

2015-04-10)

國(guó)家中醫(yī)藥行業(yè)專項(xiàng)(2015468002-2)

*

張輝，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥化學(xué)成分與應(yīng)用開發(fā)；E-mail：Zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.016